异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒检测的探讨

作者:张琳,周健,张子宽,宋永平

作者单位：450052郑州郑州市铁路中心医院检验科

   【摘要】  目的 探讨异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后巨细胞病毒(CMV)活动性感染的有效检测方法。方法分别应用普通PCR、巢式PCR、流式细胞仪同步检测13例alloHSCT后患者117份外周血标本的CMV DNA和pp65抗原。结果普通PCR检测阳性率为44.4%，巢式PCR检测阳性率为24.8%，流式细胞仪检测阳性率为30.8%。临床活动性感染率为27.4%。普通PCR检测阳性率与临床活动性感染率之间无明显相关性(r=0.207，P＞0.05)。巢式PCR和流式细胞仪的阳性检出率之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，它们和临床活动性感染有明显的相关性(r分别为0.518和0.529，P＜0.05)。结论 巢式PCR检测CMV DNA和流式细胞仪检测pp65抗原可用于alloHSCT后CMV活动性感染的诊断。

【关键词】  异基因造血干细胞移植术； 巨细胞病毒；PCR

  近年来异基因造血干细胞移植(alloHSCT)已成为治疗恶性血液病、再生障碍性贫血、某些实体肿瘤的一种有效的手段。alloHSCT后早期白细胞虽然数量上已重建，但机体免疫系统功能尚未恢复，尤其是细胞免疫功能远未重建，细胞免疫功能缺陷可使体内潜伏的或经输血或供者细胞获得的人类巨细胞病毒(human cvtome~alovirus，hCMV)复燃，引起CMV活动性感染［1］。CMV活动性感染的主要类型是巨细胞病毒间质性肺炎，是alloHSCT后的主要并发症，病死率高达70%～90%。因此 CMV活动性感染和CMV间质性肺炎是导致移植失败重要原因之一［2］。虽然更昔洛韦的使用使CMV疾病的治疗有了较大转机，但取得抗CMV显著疗效的切入点还是在于早期诊断和及时治疗。由于CMV多引起潜伏感染，而且早期所致疾病的临床表现多为非特异性，其诊断主要依靠实验室检查［3］。目前诊断方法多种多样，但哪种方法能更简便、快速、灵敏可靠地早期检测出CMV，存在很大争议。本研究应用普通PCR和巢式PCR检测CMV DNA，流式细胞仪(FCM)检测CMVpp65抗原，旨在探讨CMV感染的早期有效诊断方法。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  试剂

    淋巴细胞分离液，中国医学科学院血液学研究所生产；Taq酶、10×PCR反应缓冲液、dNTP、蛋白酶K，北京华美生物工程公司生产；引物由大连宝生物有限公司合成；小鼠IgG1抗原由北京中山生物技术有限公司提供；溶血素，Beckman Coulter公司；细胞穿孔剂、CMVpp65 C10/C11抗体、FITC标记的羊抗鼠IgGl抗体，美国IQ公司；其他试剂均为国产分析纯。

    1.1.2 仪器

    DNA扩增仪4800型，美国PE公司产；高速低温台式离心机MRL 822型，法国产；凝胶成像分析仪GDS80型，美国产；流式细胞仪(FCM)EPICS XL型，Beckman Coulter公司产。

    1.1.3  检测对象

    2003年1月～2004年2月在河南省肿瘤医院血液科行异基因造血干细胞移植术患者13例，男9例，女4例，中位年龄33(3～46)岁。慢性粒细胞白血病6例(慢性期4例，加速期1例，急变期1例，后者为同基因造血干细胞移植术后复发急单变)，非何杰金氏淋巴瘤1例，急性髓系白血病4例(AMLM2 2例，AMLM1 1例，AMLM5 1例)，急性淋巴细胞白血病1例，重型再生障碍性贫血1例。HLA相合同胞造血干细胞移植7例，非血缘关系造血干细胞移植2例，单倍型造血干细胞移植3例，非亲缘脐血干细胞移植1例。术前常规检测受者IgG、IgM抗体，排除IgM抗体阳性移植患者，血液成分输注均采用60Co照射。于回输当天、造血恢复后每10 d左右采集外周血1次，共采集标本117份。

    1.2  方法

    1.2.1 普通PCR和巢式PCR检测CMV DNA①单个核细胞(MNC)的分离及总DNA提取：取外周血5～8 ml肝素抗凝，经淋巴细胞分离液(相对密度1.077)15 000 rpm，取界面层MNC，PBS洗涤2次，备用；② PCR模板制备，取MNC用美国Gibco公司提供的Trizol一步法直接提取DNA，紫外分光光度计测DNA量；阳性对照模板为CMV AD l69株DNA;用正常人外周血MNC作为质量控制，用作空白对照，以确保实验的正确性;③ PCR扩增，取扩增产物10 μl加入40 μl PCR反应体系(1／10体积10×PCR反应缓冲液、dNTP 200 μmol/L、MgCl2 2.0 mmol/L、TaKaRa Taq 2.5 IU、引物200 ng)混匀；循环参数为37℃：5 min；94℃：1 min；95℃：5 s；60℃：40 s；40个循环；巢式PCR是先用一对外侧引物进行第一次扩增，然后将5 μl扩增产物用内侧引物进行第二次扩增;④ PCR产物分析，取PCR扩增产物15 μl加上样缓冲液3 μl，阳性、阴性对照，于2%琼脂糖凝胶共同电泳80 V 1 h，溴乙锭染色后于凝胶成像分析仪上摄像，观察结果。

 1.2.2FCM检测CMVpp65抗原 ①取上述分离的MNC，加入红细胞裂解液(溶血素)0.5 ml，混匀，室温放置10 min；1 000 rpm离心3 min，弃上清，加入1.0 ml PBS洗涤液洗涤2次；②将剩下的细胞混匀加入100 μl固定液(5%多聚甲醛)，混匀，室温温育15 min，再加1.5 ml PBS洗涤液，将离心管颠倒几次洗涤细胞，1 000 rpm离心3 min；③将剩下的细胞混匀，加入100 μl细胞穿孔剂，混匀，室温作用30 min，加2.5 ml PBS洗涤液，将离心管颠倒几次，1 000 rpm离心3 min，共洗涤3次，加PBS洗涤液使细胞浓度为107个/ml，混匀;④取2支流式细胞仪样品管，分别标记为1号和2号，每份样品平均分装成两管，每管100 μl，作为测定管和阴性对照管;⑤在l号管和2号管中分别加入10 μl抗CMVpp65抗体、10 μl小鼠IgGl抗原，混匀，置于室温温育30 min，加入2.0 ml PBS洗涤液，1 000 rpm离心3 min，弃上清，洗涤2次；⑥管中加入FITC标记的兔抗鼠IgG1抗体(二抗)，室温作用30 min，加入2.0 ml PBS洗涤液，1 000 rpm离心3 min，弃上清。混匀细胞，用流式细胞仪检测。通过阴性对照管设定荧光值的分界点，计算机自动算出阳性细胞所占的百分比，判断CMV感染情况。

    1.3 结果判定

    PCR检测以出现和阳性对照相同条带为阳性，FCM检测以pp65抗原阳性细胞数＞3%为阳性。

    1.4统计学处理

    所有数据应用SPSS 10.0统计学软件2×2列联表及χ2检验处理。

    2结果

　　普通PCR检测阳性率为44.4%(52/117)；巢式PCR检测阳性率为24.8%(29/117)；流式细胞仪检测阳性率为30.8%(36/117)。结合随后临床症状，活动性感染率为27.4%(32/117)。普通PCR检测阳性率与临床活动性感染率之间无明显的相关性(r=0.207,P＞0.05)。巢式PCR和流式细胞仪的阳性检出率之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，它们和临床活动性感染有明显的相关性(r、s分别为0.518和0.529,P＜0.05)。

    3讨论

　　人类巨细胞病毒在人群中感染非常普遍，正常人感染CMV后，由于机体免疫功能正常，病毒在感染细胞内以整合状态潜伏存在，复制水平低下，通常无临床症状。当机体免疫功能受到抑制时，潜伏的CMV可被重新激活，从而持续高水平的复制，引起活动性感染，产生有严重临床症状的CMV感染性疾病。alloHSCT中联合应用大剂量的化疗药物预处理，使骨髓短时间内处于空虚状态，外周血白细胞接近于零；同时长期联合应用多种免疫抑制剂，机体免疫功能明显受到抑制，CMV很容易被再次激活。传统上利用细胞培养分离白细胞中CMV诊断其感染，该法具有相当高的灵敏度和特异性，被认为是诊断活动性CMV感染的“金标准”［4］。但CMV只能生长在人纤维母细胞中，且病毒分离技术条件要求高，操作复杂，需要时间长，影响因素多，常导致假阴性，不能为临床提供早期、快速、准确的诊断信息，其应用受到限制［5］。目前多应用检测DNA和pp65抗原诊断CMV活动性感染。普通PCR扩增技术具有极高的灵敏度，但其最大的缺点是容易产生高本底和假阳性，在检测CMV时即使小量污染也能产生假阳性结果。本研究中定性PCR阳性检出率为44.4%，临床活动性感染为27.4%，二者之间无明显的相关性，可见普通PCR检测很容易出现假阳性。PCR阴性即可否定CMV感染，PCR阳性无法分辨是潜伏感染还是活动性感染［6］。活动性CMV感染时会出现病毒尿症、病毒血症，并可能侵犯中枢神经系统。因此如果用PCR方法在多处检测出CMV DNA可支持活动性CMV感染，但取标本困难，且价格昂贵。普通 PCR扩增时本底物影响结果的判定，应用巢式PCR可以克服这个问题［7］。巢式PCR通过二次扩增克服了单次扩增“平台期效应”的限制，提高了PCR灵敏度，一次性PCR扩增最小检出为100 fg DNA，而巢式PCR的最小检出量达10 fg DNA；并且由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性。第二阶段反应是否进行也是对第一阶段反应正确性的鉴定，保证了反应的特异性，不与其他病毒及正常人基因组DNA交叉反应，有较高的特异性。本研究中普通PCR阳性检出率为44.4%，巢式PCR阳性检出率为24.8%，二者间的差异有统计学意义(P＜0.05)，该结果与Kapusta［7］等的结论基本一致。巢式PCR的检出率和临床感染率有明显的相关性,可以应用于临床上活动性CMV感染的检测。本研究应用FCM对CMV抗原的检测，流式细胞术利用可特异识别细胞表面或细胞内抗原的单克隆抗体，既可用于检测受染细胞表面的病毒抗原，也可检测受染细胞内的病毒抗原，另外FCM检测受染细胞适用于多种标本。由于 FCM检测可对单个细胞进行多参数分析，所以FCM可同时检测同一种样本中的多种病毒或病毒抗原［8］，还能测定病毒的抗原分泌量。当阳性细胞数达到一定数值，表明感染属活动性，是早期诊断活动性感染较可靠的指标。而且阳性细胞数越多，说明病毒负荷越大，因此可作半定量分析［9］。PCR、RTPCR等技术可极为敏感地检出被病毒感染细胞内的特异性病毒核酸，但病毒核酸与单个核细胞间的关联丢失时，这种方法将不能确定细胞是否受染。FCM通过标记荧光的特异性抗体，在细胞悬液中原位杂交产生荧光给细胞表型定型，可克服这种缺点。本研究中巢式PCR阳性检出率为24.8%(29/117)；FCM阳性检出率为30.8%(36/117)，FCM阳性检出率高于巢式PCR，但二者之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，该结论和Dorenbaum［10］的双盲试验研究结果基本一致；FCM检测结果与临床感染率有明显的相关性。FCM在 CMV吸附到成纤维细胞上30 min后便可检测早期CMV抗原，因此FCM比传统的免疫荧光技术和细胞培养的病变检测等能更早期地诊断病毒感染。相对其他检测方法，FCM操作简单、客观、容易标准化，因检测细胞数量大而更加敏感，能更好地反映体内CMV感染情况。尽管巢式PCR和流式细胞仪可以用于活动性CMV感染的检测，但在造血干细胞移植早期，骨髓造血尚未重建，外周血白细胞数目很低，应用这两种方法无法进行检测，更准确完善的方法还有待进一步研究。

【参考文献】  1Machado CM，Dulley FL，Vilas Boas LS，et al.CMV pneumonia in allogeneic BMT recipients undergoing early treatment or pre-emptive ganciclovir therapy.Bone Marrow Transplant，2000，26(4)：413417.

2 Zaia JA.Prevention of cytomegalovirus disease in hematopoietic stem cell transplantation.Immunocompromised Hosts，2002，35(8)：9991004.

3 Revello MG,Gerna G.Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother,fetus，and newborn infant.Clin Microbiol Rev,2002，15(4)：680715.

4 Mansy E,Brancart F，Liesnard C，et al.A PCR based DNA hybridisation capture system for the detection of human cytomegalovirus．A comparative study with other identification methods.Virol Methods，1999，80(2)：113122.

5Sia IG Patel R.New strategies for prevention and therapy of cytomegalovirus infection and disease in solidorgan transplant recipients.Clin Microbiol Rev,2000，13(1)：83122.

6 Sia IG,Wilson JA，Espy MJ，et al.Evaluation of the cobas amplicor CMV monitor test for detection of viral DNA in specimens taken from patients after liver transplantation.J Clin Microbiol,2000，38:600606.

7 Kapusta M，Dizierzanwska D，DurinWasowivz D，et al.Detection of cytomegalovirus in infant cerebrospinal fluid by conventional PCR，nested PCR and PCRDigene.Acta Microbiol Pl，2001，50(34)：263274.

8Morello CS，Cranmer LD，Spector DH.In Vivo replication，latency and immunogenicity of murine cytomegalovirus mutants with detection in ate M 83 and M 84 genes，the putative homologs of human cytomegalovirus pp65(UL 83).J Virology，1999，73(11):76787693.

9 FowlerKB，Dahle AJ，Boppana SB，et al.Newborn hearing screening：will children withhearing loss caused by congenital cytomegalovirus infection be missed.J Pediatrics，1999，135(1)：6064.

10 Dorenbaum A，Vlenkateswaran KS，Yang G，et al.Transmission of HIV1 in infants born toseropositive mothers：PCRamplified provial DNA detected by now cytometric analysis of immun reactive beads.J Acquir ImmuneDefic Syndr Hum Retrovirl，1997，15(1):3542.