人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

　　作者：董宁征, 崔宇杰, 阮长耿* 作者单位：(苏州大学附属第一医院, 江苏省血液研究所, 卫生部血栓与止血重点实验室, 江苏 苏州 215006; 天津医科大学医学检验系, 天津 300020)

　　　　　【摘要】 　　目的: 构建人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)Fab噬菌体抗体库, 筛选抗GPIIb/IIIa特异性的噬菌体抗体, 并对其功能进行研究。方法: 取血小板膜糖蛋白抗体(抗GPIIb/IIIa)阳性的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者脾细胞, 采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPIIb/IIIa Fab噬菌体抗体库, 以表达GPIIb/IIIa的CHO123细胞筛选抗体库, 并以ELISA法检测噬菌体抗体; 用Western blot 对抗体进行鉴定, 并测定其与血小板抗原的结合; 观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响。结果: 筛选出2株能够与血小板膜GPIIb/IIIa特异性结合的Fab抗体, 其序列与人免疫球蛋白轻、 重链可变区序列具有高度同源性, 表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集。结论: 成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa Fab抗体库筛选出特异性识别GPIIb/IIIa, 具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体。

　　【关键词】 血小板,抗体,血液

　　　The First Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu Institute of Hematology, Key Laboratory of Thrombosis and Hemostasis, Ministry of Health, Suzhou 215006; Department of Clinical Laboratory, Tianjin Medical College, Tianjin 300020, China

　　[Abstract] AIM: To generation of human Fab fragment against GP GPIIb/IIIa from phage display library and to study its effect on platelet aggregation. METHODS: An antibody phage display library was constructed from spleen cells from a donor with idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP) whose antiGPIIb/IIIa antibody was positive. Highaffinity human mAbs was selected by panning against GPIIb/IIIa expressed on CHO123 cells. The binding specificity of phage antibody to GPIIb/IIIa was detected by ELISA and Western blot. And the effect of antibody on platelet aggregation was analyzed. RESULTS: After three rounds of panning with CHO123, phage antibodies against GPIIb/IIIa were enriched specifically. 2 positive phage antibodies with high specific for GP IIb/IIIa were verified, and the purified antibody can inhibited ADP induced platelet aggregation. CONCLUSION: Human antibodies against GPIIb/IIIa are obtained from phage display library.

　　[Keywords]GPIIb/IIIa,phage display,Fab,platelet aggregation

　　血栓性疾病严重威胁人类的健康, 是人类致死、 致残的重要原因。而血小板是血栓的主要成分, 血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa (GPⅡb/Ⅲa)是血小板聚集的最终共同途径中的关键因素, 在血栓形成, 特别是在动脉血栓形成过程中起着重要作用。因此阻断GPIIb/IIIa受体是治疗和预防血栓性疾病的重要措施。Abciximab(Abciximab)为GPIIbIIIa受体拮抗剂的代表, 它是抗GPIIbIIIa鼠人嵌合抗体, 是美国食品药品管理局(FDA)批准用于临床治疗的第一个单克隆抗体(mAb)。Abciximab以其高效、 特异的抗血小板聚集作用明显优于目前临床常用的抗血小板药物, 已广泛用于治疗不稳定型心绞痛和经皮冠状动脉成形术(PTCA)[1, 2]。Abciximab只是部分人源化抗体, 仍可引起人抗鼠抗体反应, 从而限制了其在临床上的推广应用。噬菌体抗体库技术使抗体达到完全的人源化成为可能。本研究中, 我们利用特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)患者产生抗血小板自身抗体的特点[4], 从ITP患者手术切除的脾脏细胞中提取RNA, 通过噬菌体抗体库技术, 构建人源性Fab噬菌体抗体库, 从中筛选出抗GPIIb/IIIa 基因工程抗体, 以期为血栓性疾病提供更为有效的治疗手段。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大肠杆菌XL1blue、 中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)、 表达GPIIb/IIIa CHO细胞株CHO123均为本室保存。噬粒pComb3H由美国Scripps研究所惠赠。辅助噬菌体VCSM13为海军总医院王琰教授惠赠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人源性抗GPIIb/IIIa Fab噬菌体抗体库的构建 根据ITP患者抗血小板自身抗体检测结果, 取抗GPIIb/IIIa抗体阳性的ITP患者手术时剥离的脾脏, 速至液氮中, 匀浆后加入TRIzol提取总RNA。以逆转录合成的cDNA第1链为模板, 分别进行Fd和轻链基因的扩增。PCR引物参照美国Scripps研究所人源抗体库构建的引物设计, 详见相关文献[3]。

　　1.2.2 噬菌体抗体库的富集筛选 将处于对数生长期的表达GPIIb/IIIa的CHO123细胞包被6孔板, 4℃封闭过夜, 加入噬菌体抗体库, 37℃ 2 h后移去噬菌体, 反复吹打洗涤 (第1轮洗1次, 第2轮洗5次, 第3轮10次), 特异性吸附的噬菌体洗脱后感染新鲜制备的 XL1Blue, 经辅助噬菌体VCSM13感染后进入下一轮的筛选, 使特异性噬菌体抗体高度富集。

　　1.2.3 可溶性Fab抗体的表达 第3轮筛选后收集感染的细菌, 提取质粒, 用Spe I及Nhe I双酶切质粒, 除去噬菌体的gIII片段, 自身环化后转化XL1blue; 挑取单个菌落, 经IPTG诱导后菌体反复冻融, 制备含可溶性Fab抗体的噬菌体上清。

　　1.2.4 Fab抗体的ELISA鉴定 将含可溶性Fab抗体的上清分别加到包被好CHO123细胞、 CHO细胞的ELISA板中, 进行phageELISA, 二抗为羊抗人HRP, OPD显色。与CHO123细胞呈阳性反应, 与CHO细胞呈阴性反应的克隆即为特异性阳性克隆。将特异性阳性克隆进行扩增, 送上海博亚生物技术有限公司测序。

　　1.2.5 Fab抗体的鉴定 (1)Western blot 检测Fab抗体的特征, 将诱导表达的Fab抗体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转移至硝酸纤维素膜上, 封闭后与HRP抗人IgG κ链抗体孵育, 洗涤后ECL显色, 观察结果。(2)Fab抗体与血小板表面抗原结合位点的鉴定。将血小板裂解液进行SDSPAGE电泳, 转移至硝酸纤维素膜上, 再与所得的Fab抗体及对照SZ21分别孵育, 洗涤后, 再分别与HRP抗人IgG κ链抗体、 HRP抗鼠IgG抗体孵育, ECL显色, 观察结果。

　　1.2.6 Fab抗体的制备及纯化 对鉴定后的表达Fab的阳性克隆进行大量扩增, 诱导表达, 制备上清。用Protein L亲和柱纯化Fab抗体, 具体按厂家说明。用结合缓冲液平衡层析柱, 将过滤后的上清上柱进行亲和吸附, 洗去未吸附的杂蛋白后, 用再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。收集洗脱液, 测定A260和A280值, 并进行SDSPAGE电泳。

　　1.2.7 血小板聚集试验(PAgT) 取献血员的抗凝血, 以800 r/min离心5 min, 得到富含血小板的血浆(PRP)。再以3 500 r/min离心10 min, 得到贫血小板血浆(PPP)。将PRP 的血小板数调至2×1011 。取0.18 mL PRP血浆至血小板聚集检测杯, 分别加不同稀释度的供试品溶液0.01 mL, 放入小搅拌棒, 37℃放置15 min, 将检测杯放入检测孔, 加入ADP(终浓度为20 mol/L), 测定血小板聚集率。

　　2 结果

　　2.1 特异性Fab抗体的筛选及序列分析 分别用表达GPⅡb/Ⅲa的细胞株CHO123及野生型CHO包板, ELISA法对60个克隆进行测定, 剔除与野生型CHO细胞反应的克隆, 获得2个ELISA活性较高的特异性克隆。对特异性阳性克隆1B8及2B6 的外源基因进行测序, 用NCBI中的Nucleotide Blast和Ig Blast Analysis of Immunoglobulin sequences分析软件, 与GenBank数据库中核苷酸序列进行同源性分析, 证实这两个克隆轻链基因和人免疫球蛋白κ轻链同源性分别高达97%和98%, 重链基因和人免疫球蛋白Fd段同源性分别高达94%和93%, 证实确为人抗体可变区基因。

　　2.2 Fab抗体的鉴定及其免疫活性检测 将诱导表达的上清在还原条件下电泳, 用HRP抗人IgG κ抗体检测, 结果见图1。阳性克隆1B8及2B6检测到相对分子质量(Mr)约23 000的轻链, 而对照XL1Blue未检测到表达条带。将诱导表达的上清与血小板裂解液孵育, 检测到Mr约95 000的GP IIIa条带, 与鼠源性抗GPⅡb/Ⅲa抗体SZ21识别条带一致, 说明筛选的阳性克隆能表达特异性识别人血小板GP IIIa的Fab抗体(图2)。

　　　2.3 Fab抗体的表达及纯化 2B6诱导表达上清用Protein L 亲和柱纯化, 结果见图3, 非还原条件下, 阳性克隆2B6经 IPTG诱导后, 其细菌裂解液在Mr约47 000 处多出 1 条蛋白带, 经亲和层析柱纯化后, 仅出现1条蛋白带; 还原条件下, Mr约23 000处出现蛋白条带。

　　　　2.4 Fab抗体对血小板聚集功能的影响 在3份不同人的抗凝血进行血小板聚集的试验中, 纯化的Fab 抗体均能抑制ADP诱导的血小板聚集, 且抑制作用随抗体浓度的增加而加强, 抗体终浓度为25 mg/L时血小板聚集抑制率达到80% (图4)。

　　　3 讨论

　　为研制完全人源的抗血小板GPIIb/IIIa抗体, 本研究采用噬菌体展示技术[5, 6], 根据抗血小板自身抗体检测结果, 选取血浆抗GPIIb/IIIa抗体阳性的ITP患者手术剥离脾脏为模板, 建立人抗人血小板的Fab噬菌体抗体库。由于ITP自身的特点, 是一种以血小板减少为主要临床表现的自身免疫性疾病, 可产生多种抗血小板自身抗体, 抗GPIIb/IIIa自身抗体是其抗血小板自身抗体的主要成分[7]。我们建立的人源性抗体库是从自然免疫后的脾脏淋巴细胞建库, 增加了库中特异性克隆的比例, 不同于其他天然的未经免疫的抗体库, 增加了从较低库容量的噬菌体抗体库中筛选到亲和力较高克隆的可能性。Fab段抗体由于其不含Fc结构, 用于临床不会导致血小板减少等副反应。

　　经富集筛选, 我们筛选出了2个与人血小板GPⅡb/Ⅲa结合活性较好的阳性克隆。经序列分析, 其基因序列符合人IgG的特征, 与人免疫球蛋白轻、 重链可变区序列高度同源。Western blot 也证实转移到硝酸纤维膜上的Fab 抗体能被HRP抗人IgG κ链抗体特异性识别。说明我们筛选到的抗体是完全人源的抗体。为研究抗体的功能, 我们将阳性克隆2B6的诱导表达上清进行纯化, 研究其对ADP诱导的血小板聚集的作用。证实其具有剂量依赖性的抑制ADP诱导的血小板聚集的功能, 与阳性抗体SZ21作用类似。

　　本研究以GPIIb/IIIa抗体阳性ITP患者手术时剥离的脾脏作为建立噬菌体抗体库的来源, 建立人抗人血小板的Fab噬菌体抗体库, 经富集筛选, 得到了能特异性识别人血小板膜GPIIb/IIIa, 具有抑制ADP诱导的血小板聚集功能的完全人源的抗体, 为研制新型抗血栓药物做了一些有益的探讨。

　　致谢: 感谢海军总医院王琰教授在本实验中给予的大力帮助!

　　【参考文献】

　　[1] Shinya G. New therapy with monoclonal antibodiesabciximab, chimeric antiGPⅡb/Ⅲa antibody[J]. Nippon Rinsho, 2002, 60(3): 492-496.

　　[2] Coller BS. AntiGPⅡb/Ⅲa drugs: current strategies and future directions[J]. Thromb Haemost, 2001, 86(1): 27-43.

　　[3] 崔宇杰, 董宁征, 庞爱明, 等. 人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa Fab噬菌体抗体库的构建[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(2): 200-204.

　　[4] 初晓霞, 侯 明, 朱媛媛, 等. 特发性血小板减少性紫癜患者IgG酶切片段F(ab′)2的免疫活性及其对血小板聚集功能的影响[J]. 中华血液学杂志, 2006, 27(3): 158-161.

　　[5] Kim S, Jang M, Ahn H, et al. Selection of an affinitymatured antibody against a defined epitope by phage display of an immune antibody library[J]. J Immunol Methods, 2008, 329(1-2): 176-183.

　　[6] Tornetta M, Fisher D, O’Neil K, et al. Isolation of human antiidiotypic antibodies by phage display for clinical immune response assays[J]. J Immunol Methods, 2007, 328(1-2): 34-44.

　　[7] Grodzicky T, Bussel JB, Elkon KB, et al. Antiplatelet antibodies associated with the CanaleSmith syndrome bind to the same platelet glycoprotein complexes as those of idiopathic thrombocytopenic purpura patients[J]. Clin Exp Immunol, 2002, 127: 289-292.