分化抑制因子NDPK-A含量与血液病的相关性研究

作者：陈艳清 贾建

 【关键词】  白血病

【摘要】 目的 研究分化抑制因子―――核苷二磷酸激酶A（NDPK-A）在血清中的含量及其与血液病的相关性，探讨血清NDPK-A含量检测对于血液病诊断和疗效判断的意义。方法 应用重组NDPK-A标准品及相应抗体建立双抗体夹心ELISA法测定NDPK-A含量，应用此方法测定正常人和血液病患者血清NDPK-A含量。结果 30例正常人血清NDPK-A含量为（4.22±0.45）μg/L，26例白血病患者血清NDPK-A含量为（21.07±12.03）μg/L，9例淋巴瘤患者血清NDPK-A含量为（32.31±8.75）μg/L，8例骨髓瘤患者血清NDPK-A含量为（14.80±5.87）μg/L。白血病患者治疗前后血清NDPK-A含量差异显著，14例治疗前患者NDPK-A含量为（31.25±10.35）μg/L，治疗后患者NDPK-A含量为（12.17±4.16）μg/L。结论 建立的双夹心ELISA法可以灵敏、准确地测定血清NDPK-A含量;NDPK-A含量检测可发展为白血病的早期诊断和疗效判断指标。

关键词 核苷二磷酸激酶A 白血病 双抗体夹心酶联免疫吸附测定法 .

【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the serum NDPK-A level and the development of leukemia，and the significance of NDPK-A determination in leukemia diagnosis. Methods A sandwich ELISA，established on the basis of recombinant human NDPK-A and its antibodies，was employed to detect serum NDPK-A concentration in healthy people and patients with hematological malignancies. Results Serum NDPK-A concentration was 4.22±0.45μg/L among 30 healthy volunteers. It was 21.07±12.03μg/L among 26 leukemia patients，and 32.31±8.75μg/L among 9l ymphoma patients，and 14.80±5.96μg/L among 8 myeloma patients. Furthermore，there was significant difference between untreated and treated leukemia patients. Serum NDPK-A concentration was 31.25±10.35μg/L among 14 untreated patients，and 12.17±4.16μg/L among 12 treated patients. Conclusion The ELISA used here was simple，sensitive and accurate for determination of serum NDPK-A level，which might be developed into an early diagnosis and prognostic factor of leukemia.

Key words NDPK（nucleoside diphosphate kinase）-A leukemia ELISA

核苷二磷酸激酶A（NDPK-A）是抑癌基因nm23-H1的编码产物，除了能够催化NDP和NTP之间的磷酸基转移反应外，还可以调节细胞增殖、分化、发育和凋亡 ［1，2］ 。多项研究表明，NDPK-A的表达量与多种肿瘤的转移潜能呈负相关，这一关系在肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤患者中尤为明显 ［3，4］ 。另外，NDPK-A可以抑制血细胞分化，最近有研究报道，血清NDPK-A含量与白血病的预后相关，高NDPK-A含量的白血病患者预后差 ［5，6］ 。为了探讨血清NDPK-A含量检测对于白血病早期诊断和疗效判断的意义，笔者建立了血清NDPK-A含量双抗体夹心ELISA检测方法，并检测了部分血样，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 酶标仪（芬兰Labsystem公司Wellscan MK-3）

1.2 主要试剂 鼠抗人NDPK-A单克隆抗体购自日本Seikagaku Kogyo公司，兔抗NDPK-A多克隆抗体购自Santa Cruz公司，HRP标记的抗兔IgG抗体购自华美生物工程公司;重组人NDPK-A标准品由日本Toho大学医学院Yoshio Honma教授惠赠;正常人混合血清、白血病患者血清参考品由本室制备。制备试剂盒所用小牛血清、Tween-20及其它化学试剂为进口或国产分析纯。组装的试剂盒置4℃保存备用。

1.3 工作原理 双夹心ELISA法。在固相酶标板上，包被鼠抗人NDPK-A单克隆抗体，可以结合标本中的NDPK-A，洗涤除去其他未结合物质后，再加入兔抗NDPK-A多克隆抗体，最后加HRP标记的抗兔IgG抗体，最后加底物TMB显色，通过比色，与系列稀释的重组人NDPK-A标准品制备的标准曲线比较，可知标本中NDPK-A含量。

1.4 标本来源 所有血清标本均来自我院，血液病患者48例（男23例，女25例），白血病26例，多发性骨髓瘤8例，淋巴瘤9例，其它3例，待查2例。正常对照为30例体检正常者血清。

1.5 测定方法 待检血清1∶2稀释后，取100μL加入预包被的酶标板，37℃湿盒中孵育1h后，洗涤液洗板5次，加入多克隆抗体100μL/孔，37℃孵育45min，洗板后加入酶标抗抗体，37℃孵育1h，加入底物TMB，37℃显色15min，2mol/L H 2 SO 4 终止反应，酶标仪测定A450/630，同时制备标准曲线，计算各血样中NDPK-A含量。

2 结果

2.1 标准曲线 rhNDPK-A标准品以生理盐水倍比稀释，浓度自1.5625～3200mg/L，共12份，平行条件测定各份标准品的光密度。取均值进行曲线拟合，结果如图1中对数刻度标准曲线所示。曲线拟合结果表明，在3.125～3200mg/L范围内，NDPK-A含量与光密度有极好的相关性（y=a+bx+cx 2 ，s=0.0154，R 2 =0.997）。

2.2 方法的稳定性 rhNDPK-A标准品（10ng/mL）、正常血清参考品以及白血病血清参考品在同一块96孔酶标板上平行测定10个反应孔，结果表明，批内变异系数为3.58%～6.34%;连续测定3天，结果表明，批间变异系数为4.72%～8.35%，说明本方法及制备的试剂盒稳定性良好（表1）。

图1 NDPK-A测定标准曲线（略）

表1 双抗体夹心ELISA法测定NDPK-A含量的稳定性研究结果（略）

2.3 健康人血清NDPK-A含量 取体检正常，年龄15～60岁的健康志愿者血清30份，参照本文所述方法测定血清NDPK-A含量，结果表明，健康人血清NDPK-A含量为（4.22±0.45）μg/L。

2.4 血液病患者血清NDPK-A含量 白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等三类血液病患者血清NDPK-A含量如表2所示，统计学分析结果表明，3种血液病患者血清NDPK-A含量均与正常人差异显著。

表2 血液病患者血清NDPK-A含量 （略）

2.5 白血病患者治疗前后NDPK-A含量变化 26例白血病患者中，14例为治疗前血样，12例为治疗后血样。数据分析结果（图2）表明，治疗前患者血清NDPK-A含量为（31.25±10.35）μg/L，治疗后患者NDPK-A含量为（12.17±4.16）μg/L，二者差异有非常显著性（P<0.001）。

3 讨论

白血病的诊断是以形态学诊断为基础，结合免疫学、细胞遗传学和分子生物学检验的MICM综合性诊断方法 ［7］ 。对于急性白血病来说，如何区分高复发风险的患者是一个棘手的问题。白细胞计数、细胞遗传学分析、年龄、免疫表 型以及Auer小体是AML常用的预后因子，但这些指标均缺乏特异性。本文的研究结果表明，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等3类血液病患者血清NDPK-A含量明显高于正常人群，并且，白血病患者治疗前后NDPK-A含量差异显著，这初步提示NDPK-A含量测定可作为血液病的辅助诊断指标，并且，有可能发展为白血病的疗效判断因子。

图2 白血病患者治疗前后血清NDPK-A含量（略）

肿瘤标志物在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大实用价值。理想的肿瘤标志物应该具有敏感性高、特异性好、有器官特异性、能反映肿瘤的动态变化、容易测定等特点。由于肿瘤的复杂性，发现“理想”的肿瘤标志物十分困难。nm23-H1作为公认的抑癌转移基因，已有较多的关于该基因与实体瘤转移潜能的相关性研究［1，3］ ，但对于nm23-H1的蛋白产物NDPK-A作为肿瘤标志物的研究还处于初级阶段。本文的结果初步展示了NDPK-A含量检测的临床意义，下一步我们将增加样本例数，细分各种影响因子，深入研究NDPK-A含量与白血病及骨髓瘤、淋巴瘤等血液病疗效及预后之间的关系。

参考文献

1 Fan Z，Beresford PJ，Oh DY，et al. Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis，and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor. Cell，2003，112（5）:659-672.

2 Biggs J，Hersperger E，Steeg PS，et al. A Drosophila gene that is homologous to a mammalian gene associated with tumor metastasis codes for a nucleoside diphosphate kinase. Cell，1990，63:933-940.

3 Narayanan R，Ramaswami M. Regulation of dynamin by nucleoside diphosphate kinase. J Bioenerg Biomembr，2003，35（1）:49-55.

4 Roymans D，Willems R，Van Blochstaele D R，et al. Nucleoside diphosphate kinase（NDPK/NM23）and the waltz with multiple partners: possible consequences in tumor metastasis. Clinical and Experimental Metastasis，2002，19（16）:465-476.

5 Niitsu N，Okabe-Kado J，Kasukabe T，et al. Prognostic implications of the differentiation inhibitory factor NM23-H1 protein in the plasma of aggressive non-Hodgkin’s lymphoma. Blood，1999，94（10）:3541-3550.

6 Niitsu N，Okabe-Kado J，Nakayama M，et al. Plasma levels of the differentiation inhibitory factor NM23-H1 protein and their clinical implications in acute myelogenous leukemia. Blood，2000，96（3）:1080-1086.

7 谭齐贤.临床血液学和血液检验.第三版.北京:人民卫生出版社，2003，201.