靶向肝脾巨噬细胞治疗血小板减少性紫癜的实验研究

　　作者：谭忠华    作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院核医学科， 上海 200025

　　【摘要】  本研究制备兔抗鼠血小板血清以建立SD大鼠免疫性血小板减少性紫癜（ITP）模型，使用明胶微粒装载二氯亚甲基二膦酸（Cl2MDP），并将药物导向模型的肝脾巨噬细胞内以杀伤巨噬细胞或降低其免疫活性，以期达到治疗ITP的目的。每24小时重复注射1次抗血小板血清150 μl，所建立的SD大鼠的ITP模型中，血小板计数于实验期间能维持在低于50×109/L的病理水平。用Cl2MDP明胶微粒进行巨噬细胞株RAW264.7的MTT试验及模型的实验性治疗，以治疗前后的血小板计数和出血时间作为疗效的观察指标。结果表明：Cl2MDP明胶微粒呈剂量依赖关系抑制体外培养的巨噬细胞的增殖并可迅速、有效地升高模型鼠血小板的数量，平均达180×109/L水平，并能维持血小板计数在生理范围内而不下降。此外，预先注射Cl2MDP明胶微粒的SD大鼠可避免抗血小板血清引起的血小板计数降低。结论：Cl2MDP明胶微粒静脉注射可以有效地提高SD大鼠ITP模型的血小板数量，达到避免发生出血的安全水平。这种靶向巨噬细胞的药物输送技术为ITP的治疗提供了一种新的治疗理念和方法，值得进一步深入研究。

　　【关键词】  免疫性血小板减少性紫癜 二氯亚甲基二膦酸盐 明胶微粒 巨噬细胞 靶向治疗

     Experimental Study for  Thrombocytopenic Purpura Therapy by Targeting Macrophages in Liver and Spleen

    TAN ZhongHua, LI PeiYong, ZHU YiHua1, JI XiaoWen, WU ZhenYu

    Department of Nuclear Medicine, Ruijin Hospital,  The Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China; Key Laboratory, Division of Education on Preparation and Application of Superfine Materials, Huadong University of Science and Engineering, Shanghai 200237, China

    Abstract    The study purpose was to  explore whether dichloromethylene diphosphonate (Cl2MDP)loaded gelatin particles can induce the depletion of macrophage in reticuloendothelial system of liver and spleen or can depress the immunity of macrophage in SD rat models of immune thrombocytopenic purpura (ITP) to treat the ITP rats.  New Zealand rabbits were immunized with platelets of SD rats to prepare rabbit antirat platelet serum, and the serum was intravenously injected into SD rats to produce the ITP model. In experimental ITP models, 150 μl of antiplatelet serum was intravenously injected into SD rats per 24 hours. The platelet counts maintained pathological level and were persistently less than 50×109/L in the models during experiment  process. The MTT test of macrophage RAW264.7   was carried out  by means of  Cl2MDPloaded gelatin particles in vitro. After intravenous injection of a group dose of Cl2MDPgelatin particles, the platelet counts of the rats were measured at the time of 4 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours, respectively, and bleeding times were detected in 24 hours. The results showed that Cl2MDPloaded gelatin particles  increased the platelet counts of ITP models to mean of 180×109/L, a physiological level in 24 hours after injection, and  kept this platelet level through whole  process of   120 hours. Furthermore, rats  pretreated with Cl2MDPloaded gelatin particles avoided  the decrease of platelet counts significantly when they were injected antiplatelet serum. It is concluded   that Cl2MDPloaded gelatin particles  restrain multiplication of macrophage RAW264.7, and  promptly, effectively restore platelet counts of ITP models to physiological level  in a dose dependent manner. So, the targeting therapy of drugloaded gelatin particles offers a new idea and approach to treat ITP, and this strategy is worthy of further studies.

    Key words    immune thrombocytopenic  purpura;  dichloromethylene diphosphonate; gelatin particle;  macrophage; targeting therapy

    J Exp Hematol 2007; 15(1):103-107

    免疫性（原发性）血小板减少性紫癜（ITP）是一种由抗血小板抗体引起的自身免疫性的出血性疾病，其临床特征为患者自身抗血小板抗体导致的血小板破坏增加而使循环血小板减少，以及由此引起的皮肤、粘膜出血。研究表明，ITP患者血小板的破坏发生在网状内皮系统，尤其是在肝脾的巨噬细胞中［1］。目前ITP的临床常规治疗方案，如糖皮质激素、脾切除、免疫抑制剂、达那唑和大剂量γ球蛋白等治疗的缓解率不理想且易复发，毒副作用较大，而在治疗无效和缓解后复发的患者中不少人存在发生致命出血的危险［2，3］。一些研究人员和临床医师对美国血液学会制订的ITP诊断与治疗指南［4］，存有异议［5］。这表明对ITP的治疗仍未完全解决，探索其有效的治疗手段有着重要的现实意义。本实验在我们已经研究制备的Cl2MDP明胶微粒基础上［6］，进行巨噬细胞株RAW264.7的MTT试验及治疗SD大鼠ITP的初步实验研究，结果令人满意。

     主要试剂

    明胶微粒（粒径300-500 nm、表面带8.9 mV正电荷的Zeta电位）由华东理工大学超细材料制备与应用教育部重点实验室制备；二氯亚甲基二瞵酸盐（Cl2MDP，Sigma公司产品），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司产品），DMSO（Sigma公司产品），DMEM（Gibco公司产品），胰酶EDTA（Gibco公司产品），青霉素、链霉素（Gibco公司产品），胎牛血清（FCS，Gibco公司产品）；其余所用试剂均为国产，分析纯。

    细胞株和实验动物

    RAW264.7巨噬细胞株为中国科学院上海细胞生物所保存株。SD大鼠、新西兰大白兔购自上海第二医科大学附属瑞金医院动物房。

    Cl2MDP明胶微粒的制备［6］

    明胶微粒对药物的包封、肝脾靶向性和生物相容性研究在我科实验室进行，载药（Cl2MDP）量为5  mg/mg明胶微粒。

    巨噬细胞的MTT试验

    细胞培养  巨噬细胞株RAW264.7常规复苏后以含10% FCS的DMEM培养液于37℃、5% CO2中孵育24小时。移去培养液及未贴壁细胞，再加入培养液继续孵育至细胞长满培养皿底。以0.25%胰酶+EDTA消化30秒，制成细胞悬液传代，至细胞长满培养皿底后再次制成细胞悬液进行MTT试验。

    MTT试验  ①铺板：在24孔培养板中加入细胞悬液，使实际铺板细胞数为每孔106个。于37℃、5% CO2孵育24小时使巨噬细胞贴壁。②干预：将原培养液吸净，分别加入含10% FCS 的DMEM 和不同剂量的Cl2MDP明胶微粒、Cl2MDP，各为0、0.02、0.04、0.06、0.08及0.1 mg（以所含Cl2MDP计）5个剂量组，明胶微粒组则加入含10% FCS 的DMEM 和0.1 mg明胶微粒，对照组只加入含10% FCS 的DMEM。以上共12组，于37℃、5% CO2孵育24小时。③加MTT：将每孔中的培养液吸净，加入新鲜配制的MTT溶液（2 mg/ml）250  μl，在37℃、5% CO2条件下继续孵育4小时。④显色：将培养板倒置在滤纸上，轻拍板底，使其中MTT溶液尽可能流出。然后每孔加入DMSO 750 μl，摇匀后室温放置15分钟。然后将每个培养孔中的液体吸出50 μl加入96孔板，每个干预因素加6孔。⑤测值：用酶标仪以570 nm测每孔溶液的OD值，按公式计算细胞抑制率。实验结果取6孔平均值。

    细胞抑制率=（对照组OD值-干预因素组OD值）/

    对照组OD值×100%。

    兔抗鼠血小板血清的制备

    分离血小板  SD大鼠乙醚麻醉，腹主动脉取血，全血与抗凝剂（3.8%柠檬酸钠）之比为9∶1。室温， 125×g离心10分钟，无菌下移取上层富血小板血浆2 000×g离心20分钟，移除上层血浆；沉淀的血小板以0.05 mol/L pH 7.4的PBS洗涤2次，生理盐水悬浮，取少许稀释后计数。

    免疫  用SD大鼠血小板耳缘静脉注射免疫新西兰大白兔，每只约1×109个血小板，分别在首次免疫后的第15、30、40天时重复免疫1次。

    提取抗血小板血清  末次免疫后10天，5%巴比妥麻醉，颈动脉插管（预先以肝素湿润管壁）取血。兔的全血于室温下放置1小时后移至4℃冰箱过夜，然后4℃、2 000×g离心20分钟，然后于无菌条件下移取上层血清分装，-20℃冻存备用。

    ITP模型的建立［7，8］

    为了避免所使用的IgG聚合引起局部阻塞，采用未经处理的兔抗鼠血小板血清代替纯化抗体建立ITP模型。

    单次不同剂量注射  抗血小板血清50、100、150、200、300 μl，以SD大鼠血清稀释至500 μl后静脉注射，每组5只，另取5只静脉注射普通兔血清500 μl为对照。分别于注射前（0小时）、注射后4、24、48、72、96小时取血进行血小板、白细胞和红细胞计数。

    多次同一剂量注射  鉴于150 μl组的血小板计数于静脉注射后4小时降至最低为（38.8±4.8）×109/L（图1），且不至引起实验动物死亡。取SD大鼠5只，每24小时重复静脉注射抗血小板血清150 μl，在相同的时间点取血进行血小板计数。

    出血时间测定  抗血小板血清注射后24小时在SD大鼠的尾巴上，用无菌刀片切出深约3 mm与尾静脉平行的创口（注意避开能目击的静脉），每隔30秒用滤纸吸去出血直到出血完全停止，记录这期间的时间。

    Cl2MDP明胶微粒对ITP模型的实验性治疗

    不同剂量Cl2MDP明胶微粒对ITP动物模型的疗效  按多次同一剂量（150 μl）注射方法制备ITP动物模型。首次注射抗血小板血清4小时后取血进行血小板计数（0小时），再静脉注射不同剂量的Cl2MDP明胶微粒（所含Cl2MDP分别为2、4、6、8 mg），每组5只。于Cl2MDP明胶微粒注射后24、48、72、96、120小时取血进行血小板计数。

    Cl2MDP明胶微粒抑制抗血小板血清的作用  同上方法制备ITP动物模型。首次注射抗血小板血清4小时后取血进行血小板计数（0小时），分别注射Cl2MDP明胶微粒（含Cl2MDP 8 mg）、明胶微粒（2 mg）、Cl2MDP（8 mg），每组5只；另取5只SD大鼠先注射Cl2MDP明胶微粒（含Cl2MDP 8 mg），24小时后进行血小板计数（0小时），再静脉注射抗血小板血清150 μl，并每24小时重复1次。

    上述各组分别在首次计数后24、48、72、96小时取血进行血小板计数，并在24小时按前述方法测定出血时间。

    统计学处理

    采用SAS 6.12统计软件，血小板计数以±SD表示，进行t检验。

    结    果

    MTT试验

    RAW264.7巨噬细胞的MTT试验结果见附表。结果显示，Cl2MDP明胶微粒组的巨噬细胞增殖抑制率显著高于其它两组（P<0.01），且其组内各剂量间的MTT试验结果也有明显差异（P<0.05），表明Cl2MDP明胶微粒可以剂量依赖的方式抑制巨噬细胞株RAW264.7的增殖。

    SD大鼠ITP模型

    单次不同剂量注射  SD大鼠静脉注射抗血小板血清后血小板计数的变化见图1。在50、100、150 μl剂量组，注射后4小时血小板计数逐渐下降至最低，分别为（92.5±7）×109/L、（61.7±8.3）×109/L、（38.8±4.8）×109/L，其后逐渐上升，至48小时恢复正常水平。对照组的血小板计数未见明显变化，各组红细胞和白细胞计数均未见明显异常变化。

    此外，200 μl组中于注射抗血小板血清后4小时内有2只动物死亡，存活的3只鼠4小时血小板计数为（14.8±2.9）×109/L，300 μl组动物全部死亡。解剖发现死亡鼠的内脏如肝、脾、肺及心包等存在程度不等的出血点或出血。

    Figure 1. Platelet counts after single intravenous injection with different dose of antiplatelet serum in SD rats.

    多次同一剂量注射  150 μl抗血小板血清每24小时重复静脉注射后血小板计数的变化见图2。图中对照组和单剂量组引用图1中数据。结果显示每24小时重复静脉注射1次150  μl抗血清，能够使SD大鼠的血小板计数维持在低于50×109/L的病理水平（与对照组比较，P<0.01）。

    Figure 2. Platelet counts after multiple intravenous injection with the same dose of antiplatelet serum in SD rats.

    出血时间  对照组SD大鼠的出血时间均<2分钟（n=5），而实验组的出血时间均>3分钟（n=15），显示由抗血小板血清静脉注射引起血小板下降后，也相应的导致出血时间明显延长（P<0.01）。

    Cl2MDP明胶微粒对鼠ITP模型的实验性治疗

    Cl2MDP明胶微粒对ITP模型的疗效  各组剂量Cl2MDP明胶微粒治疗后血小板计数的变化见图3。由图3可见，不同剂量的Cl2MDP明胶微粒能使SD大鼠的血小板计数迅速得到恢复，其恢复的程度和持续时间与注射的剂量有关。8 mg剂量组的疗效较佳，血小板恢复到平均180×109/L左右，在实验期间能维持在正常范围，未出现再次明显下降。

    Figure 3. Platelet counts after treatment with different dose of Cl2MDPgelatin particles in ITP models.Cl2MDP明胶微粒对抗血小板血清作用的影响  各组SD大鼠在不同时间点的血小板计数见图4。由图4可见，单纯明胶微粒或Cl2MDP对模型不产生治疗作用，其血小板计数在实验期间未见明显变化，而预先注射Cl2MDP明胶微粒可避免注射抗血小板血清引起的血小板下降。

    Figure 4. Cl2MDPGelatin particles avoid the effect of antiplatelet serum.Ab:antiplatelet serum.

    出血时间  在Ab+明胶微粒组和Ab+Cl2MDP组，出血时间均>4分钟；在Ab+Cl2MDP明胶微粒组和Cl2MDP明胶微粒+Ab组则均<2分钟，两者间比较有显著差异（P<0.01）。

    讨    论

    治疗ITP的靶向药物输送方法早在1978年已有报道［9］，Ahn等［9］使用载有长春碱的血小板作为巨噬细胞的“特洛伊木马”，希望药物进入细胞后再释放出来杀死巨噬细胞，但其研究未达预期目的。直到有研究者发展了一种被称为巨噬细胞“自杀”技术的研究方法［10］，这一ITP的治疗策略才重新引起了人们的关注。这种方法现已成为研究生理或病理状态下巨噬细胞功能的常用手段，并开始研究用于治疗一些以巨噬细胞为药物作用靶点的疾病（如ITP、AIDS等）。

    建立动物ITP模型的方法主要有3类，化学药物诱导、使用抗血小板抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）制备或使用有自发发生自身免疫性疾病倾向的动物种系［7，8，11，12］。本实验使用抗血小板抗体建立SD大鼠ITP模型，单次注射一定剂量的抗体所导致的血小板减少仅持续不到24小时，至48小时已恢复正常水平。而通过每24小时重复注射150 μl抗血小板血清，能够维持血小板计数持续<50×109/L，出血时间延长到>4分钟（正常<2分钟），而红细胞和白血胞计数未见明显降低，符合ITP的实验室检查表现，这表明模型的建立是成功的。但临床上除儿童ITP多表现为急性外，成人ITP大多起病缓慢，而通过注射抗体建立模型从病理上看应属一种急性的疾病发生过程，因此这种动物模型能否反映成人ITP的病理特征尚需进一步研究。

    在SD大鼠ITP模型的治疗中发现，血小板计数在用药后恢复的程度和持续时间与所使用的药物剂量有关，呈剂量依赖关系，这一结果与巨噬细胞株RAW264.7的MTT试验结果相符。Cl2MDP明胶微粒注射后24小时就可使模型的外周血小板数量迅速恢复到不致发生出血的正常水平，出血时间也随之缩短，而明胶微粒和Cl2MDP单独使用则没有这种作用。此外，预先使用Cl2MDP明胶微粒处理实验鼠能避免抗血小板血清引起的血小板降低及出血时间延长，防止发生抗血小板抗体诱导的ITP。我们先前已对明胶微粒的肝脾靶向性进行了研究［6］，结果表明，Cl2MDP明胶微粒进入SD大鼠体内主要被肝脾巨噬细胞摄取清除，其余脏器除肺、肾有少量聚集外基本没有载药微粒分布。结合本实验结果表明Cl2MDP明胶微粒能够抑制肝脾巨噬细胞清除被抗血小板抗体激活的血小板，因此尽管每24小时重复注射抗血小板血清，但实验期间血小板计数不会再次下降。

    Cl2MDP是临床上治疗骨质疏松和肿瘤骨转移的常用药物，为水溶性，难以通过细胞膜，将其与300-500   nm的明胶微粒连接，则可通过肝脾巨噬细胞对明胶微粒的摄取而进入细胞内发挥治疗作用。目前药物的杀伤细胞或抑制细胞活性的机制尚未完全清楚，但现有研究已证实此药对吞噬细胞（巨噬细胞、破骨细胞等）有毒性作用［13］。在以脂质体为载体进行的靶向巨噬细胞的动物研究中，研究者认为它的作用机理是：抑制或干扰细胞的物质代谢（如溶酶体酶等的合成）与能量代谢（形成不能水解的ATP类似物）；影响单核吞噬细胞分泌细胞因子的种类和量，抑制干细胞的分化和成熟细胞的功能；在体外可诱导肿瘤细胞（骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌等）和巨噬细胞凋亡等［14］。但本实验中Cl2MDP产生疗效的确切机制及其对全身免疫功能的影响还有待明确。

    我们的实验结果和文献资料［7，8］均表明，使用明胶微粒作为Cl2MDP的载体将其定向输送到肝脾巨噬细胞治疗ITP是可行的，尤其对急性发作所致血小板迅速下降可能导致的出血有较好的治疗与预防作用，同时还可避免常规治疗中伴随的药物毒副作用较大的缺点。尽管目前的资料尚不能表明这种靶向治疗的方法能够有效地解决ITP临床常规治疗方案容易复发的难题，其药代动力学和确切的治疗机制也有待阐明，但作为有良好应用前景的ITP治疗的研究方向值得重视。

【参考文献】  1Cines DB, Blanchette VS. Immune thrombocytopenic purpura. N Engl J Med, 2002, 346: 995-1008

2Gernsheimer T, Stratton J, Ballem PJ, et al. Mechanisms of response to treatment in autoimmune thrombocytopenic purpura. N Engl J Med, 1989; 320: 974-980

3Berchtold P, McMillan R. Therapy of chronic idiopathic thrombocytopenic purpura in adults. Blood, 1989, 74: 2309-2317

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5George JN, Davidoff F. Idiopathic thrombocytopenic purpura. Lessons from a guideline. Ann Intern Med, 1997; 126: 317-318

6谭忠华, 李培勇, 朱以华. 99TcmCl2MDP明胶微粒的制备及其肝脾靶向性研究. 中华核医学杂志, 2005, 25: 181-183

7AlvesRosa F, Stanganelli C, Cabrera J, et al. Treatment with liposome encapsulated clodronate as a new strategic approach in the management of immune thrombocytopenic purpura in a mouse model. Blood, 2000; 96: 2834-2840

8AlvesRosa F, Stanganelli C, Cabrera J, et al. Rapid recovery of platelet count following administration of liposomeencapsulated clodronate in a mouse model of immune thrombocytopenia. Br J Haematol, 2002; 116: 357-366

9Ahn YS, Byrness JJ, Harrington WJ, et al. The treatment of idiopathic thrombocytopenia with vinblastineloaded platelets. N Engl J Med, 1978; 298: 1101-1107

10Van Rooijen N. The liposome mediated macrophage “suicide” technique. J Immunol Meth, 1989; 124: 1-6

11Oyaizu N, Yasumizu R, MiyamaInaba M, et al. (NZW × BXSB) F1 mouse. A new animal model of idiopathic thrombocytopenic purpura. J Exp Med, 1988; 167: 2017-2022

12Kuter DJ, Rosenberg RD. The reciprocal relationship of thrombopoietin (cMpl Ligand) to changes in the platelet mass during busulfaninduced thrombocytopenia in the rabbit. Blood, 1995; 85: 2720-2730

13Plosker GL, Goa KL. Clodronate. A review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in resorptive bone disease. Drugs, 1994; 47: 945-982

14Van Rooijen N, Sanders A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J Immunol Methods, 1994; 174: 83-93