基因造血干细胞移植治疗恶性血液病的效果

      ［摘要］目的 探讨异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）治疗恶性血液病的效果。方法 10例恶性血液病病人进行Allo-HSCT治疗，供者中9例为HLA完全相合的同胞，1例为HLA半相合的同胞。预处理方案包括:马利兰-环磷酰胺、马法兰-足叶乙甙-阿糖胞苷-环磷酰胺、氟达拉滨-阿糖胞苷-马法兰-环磷酰胺、卡莫司汀-足叶乙甙-阿糖胞苷-环磷酰胺。结果 全部病人均获得造血重建，中性粒细胞≥0.5×109 /L、血小板>20×109 /L的中位时间分别是14.5、18.3 d;5例发生急性移植物抗宿主病（GVHD），6例发生慢性GVHD，4例血型不合者均于移植后3个月内血型转为供者型。10例病人28 d时DNA图谱均转为供者型。随访4～23个月尚无复发及死亡病例。结论 Allo-HSCT虽然会发生GVHD等严重并发症，但仍然是治疗恶性血液病的最有效的方法。HLA半相合同胞Allo-HSCT的开展解决了供者来源少的难题。

　　［关键词］ 造血干细胞移植;异基因;血液肿瘤;治疗结果

　　EFFECTS OF ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION IN THE TREATMENT OF MALIGNANT HE-MATOPATHY

　　YUAN CHENG-LU， LI YING， SHI CHUN-LEI， et al

　　（Department of Hematology ，Qingdao Central Hospi-tal， Qingdao 266042， China）

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo study the efficacy of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation （Allo-HSCT） for malig-nant hematopathy. MethodsTen patients with malignant hematopathy received Allo-HSCT. Nine donors were HLA-identical sibling， one was HLA-haploidentical sibling. The pretreatments included: Busulfan/Cyclophosphamide，Melphalan/Etoposide/Cytarabine/Cyclophosphamide，Fludarabine/Melphalan/Cytarabine/Cyclophosphame，BCNU/Etoposide/Cytarabine/Cyclophospha-mide. ResultsAll the patients engrafted gained hematopoietic reconstitution， absolute neutrophil count ≥0.5×109 /L in 14.5 days， platelet count >20×109 /L in 18.3 days. Acute graft-versus-host disease （GVHD） was observed in five patients，and chronic GVHD in six. The blood type of four patients whose ABO blood type mismatched with the donors' were turned into donors' type in three months after HSCT. All patients of Allo-HSCT achieved full donor-type engraftment，proved by DNA order analysis in 28 days after Allo-HSCT. No relapse or death was found during four to 23 months' follow-up. ConclusionAllogeneic hematopoie- tic stem cell transplantation is the most effective method in the treatment of malignant hematopathy，although it causes the severe complication of graft-versus-host disease. HLA-haploidentical transplantation will solve the problem of donor-shortage.

　　［KEY WORDS］hematopoietic stem cell transplantation; allogeneic; hematological neoplasms; treatment outcome

　　近年来，随着血液学及相关领域基础和临床研究的不断进步，人们对造血干细胞移植的认识越来越深入，预处理技术、免疫抑制剂的应用及移植相关并发症的处理水平日渐提高，异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）已经成为治疗恶性血液病的最有效手段。我院自2004年3月至今应用异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病病人10例，现报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 10例病人中，男6例，女4例;年龄13～50岁，中位年龄为32.8岁;其中急性淋巴细胞白血病 （ALL） 4例，急性非淋巴细胞白血病（ANLL） 2例（分别为ANLL-M2a、ANLL-M4 ），慢性粒细胞白血病（CML） 2例（慢性期、急变期各1例），非霍奇金淋巴瘤（NHL） 2例（弥漫性大B细胞型、免疫母细胞型各1例）。全部病例均经骨髓细胞形态学、免疫学、细胞遗传学或病理学检查确诊。

1.2 移植方式 10例病人采用Allo-HSCT治疗，其中9例为HLA配型完全相合的同胞供者，均采用异基因外周血造血干细胞移植;1例为HLA配型半相合的同胞供者，采用异基因外周血联合骨髓造血干细胞移植。

　　1.3 移植过程 10例健康供者采用G-CSF进行动员，动员后应用CS-3000血细胞分离机（美国Baxter公司）分离外周血造血干细胞， 采集1～2次， 共采集单个核细胞（5.21～9.32）×108 /kg（平均7.41×108 /kg），CD+ 34细胞（4.72～9.95）×106 /kg（平均6.89×106 /kg）。骨髓造血干细胞的采集在手术室进行，每人采集骨髓600 mL，单个核细胞2.21×108 /kg，CD+ 34细胞1.98×106 /kg。外周血造血干细胞不需冻存，采集的骨髓去除红细胞和血浆后分离出有核细胞，直接回输给病人。

　　1.4 预处理方案 预处理方案包括:改良的马利兰-环磷酰胺（Bu-Cy）方案［马利兰1 mg/kg口服或0.8 mg/kg静滴，每6 h 1次，共4 d;环磷酰胺60 mg/（kg?d），共 2 d ］。MEAC方案［马法兰140 mg/m2 ，1 d;足叶乙甙100 mg/m2 ，每12 h 1次，共4 d;阿糖胞苷 100 mg/ m2 ，每12 h 1次，共4 d;环磷酰胺45 mg/（kg?d），共4 d］。FMAC方案［氟达拉滨30 mg/（m2 ?d），共5 d;马法兰140 mg/m2 ，1 d;阿糖胞苷100 mg/m2 ，每12 h 1次，共4 d;环磷酰胺45 mg/（kg?d），共4 d］或BEAC方案［卡莫司汀250 mg， 1 d ;足叶乙甙100 mg/m2 ，每12 h 1次，共4 d;阿糖胞苷100 mg/m2 ，每12 h 1次，共4 d;环磷酰胺 45 mg/ （kg?d），4 d］。

　　1.5 并发症的防治

　　1.5.1预防感染 所有病人均进入百级层流无菌病房，接受严格的全环境保护，并口服肠虫清、氟哌酸、阿昔洛韦、大扶康等，以预防感染。预处理结束后当白细胞<1.0×109 /L或中性粒细胞<0.5×109 /L时应用G-CSF，并继续预防应用口服抗生素。 　　　　1.5.2预防移植物抗宿主病（GVHD） 采用常规小剂量环孢霉素A（CsA）联合短疗程甲氨蝶呤的方案预防GVHD，部分病人加用麦考酚酸酯（MMF），HLA半相合Allo-HSCT者加用抗胸腺免疫球蛋白（ATG）。

　　1.5.3预防出血性膀胱炎 从预处理前12 h开始水化、碱化尿液并强迫利尿，应用环磷酰胺的同时及用后3、6、9 h静滴美司那0.8～1.2 g，以预防出血性膀胱炎。

　　1.5.4预防肝静脉闭塞症（VOD） 所有病人自预处理开始即给予肝素、复方丹参预防VOD，至血小板<20×109 /L或有出血倾向时停用，当造血恢复，血小板>20×109 /L或出血停止再次应用28 d。部分病人加用前列腺素E脂质微球。同时，应用甘利欣、谷胱甘肽或肝得健保护肝功能。

　　1.5.5预防间质性肺炎（IP） 所有病人入层流病 房前即开始口服阿昔洛韦，并每周检测CMV-IgM水平2次。有2例病人改用更昔洛韦5 mg/（kg?d）静滴，预防CMV感染。所有病人在移植后半年内间断静滴丙种球蛋白。

　　1.6 植活证据 回输造血干细胞后每天查血常规，以中性粒细胞（ANC）≥0.5×109 /L及血小板>20×109 /L连续 3 d为 植活间接证据。供、受者ABO血型不合者以检测病人血型转变为供者血型作为植活直接证据。供、受者性别不同者以检测病人血细胞染色体转变为供者血型作为植活直接证据。所有供、受者于7、14、21、28 d取外周血标本，提取DNA后，将DNA样品采用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列（STR-PCR），并结合全自动毛细管电泳分析法早期鉴定供者造血干细胞在病人体内植入情况。

　　2 结果

　　2.1 造血重建 10例病人移植后全部获得造血重建，ANC≥ 0.5× 109 /L的中位时间是14.5 d （10～18 d）;血小板>20×109 /L中位时间是18.3 d（12～30 d）。骨髓检查4例14 d时有核细胞增生活跃，5例28 d时有核细胞增生活跃，1例35 d时有核细胞增生活跃。

　　2.2 Allo-HSCT植活检测结果 4例血型不合者在3个月内血型转为供者血型;4例性别不同者，于移植后1月内全部转为供者型;2例CML病人移植前Ph染色体阳性，移植后Ph染色体消失;14 d时STR-PCR检测9例转化为供者型，有1例仍为病人型;28 d时全部转化为供者型（完全嵌合体）。

2.3 移植相关并发症 8例病人出现不同程度的感染，2例病人出现带状疱疹，1例病人出现CMV-IgM阳性。5例病人发生急性GVHD，其中Ⅰ级2例，主要表现为皮肤红疹或口腔黏膜白色苔藓样变;Ⅱ级1例，主要表现为恶心、腹泻;Ⅲ级2例，主要表现为皮肤红疹、口腔黏膜细小水疱、白色苔藓样变，腹痛、腹泻（大便量> 1 500 mL/d ）;未发生Ⅳ级GVHD;上述病人经应用甲基泼尼松龙、MMF、调整CsA剂量或由口服改为静滴并应用丙种球蛋白后均很快控制。Allo-HSCT后随访4～23个月，目前有6例发生慢性GVHD，其中局限性3例（有2例曾发生急性GVHD），广泛性3例（均曾发生急性GVHD）。采用HLA半相合 4期袁成录，李颖，史春雷，等.异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病的效果343Allo-HSCT治疗的病人现为移植后4个月，目前尚无GVHD发生。1例病人于44 d发生出血性膀胱炎。所有移植病人均未发生VOD、IP、癫痫样抽搐等并发症。

　　2.4 复发、死亡及生存情况 随访4～23个月，目前尚无复发和死亡病例。

　　3 讨论

　　Allo-HSCT的开展，为许多恶性血液病病人治愈疾病、长期存活找到了最有效的治疗方案。据国际骨髓移植登记处统计34个国家105个移植中心的移植结果显示，HSCT治疗恶性血液病1年的无病生存率为61%～70%，移植相关病死率为30%～35%［1］。本文尚无死亡病例，可能与病例数较少及随访时间较短有关，仍需进一步扩大病例数观察。Allo-HSCT后植入状态的检测对于判断移植是否成功、移植后免疫抑制剂的应用是否合理、供者淋巴细胞输注的时机等有重要意义。最常用的植入证据证明方法如下。①红细胞抗原系统的检测:迄今已发现20多个血型系统，共400多种红细胞血型，人类个体红细胞血型表型至少在1×109 种以上，因而红细胞血型表型可以作为植入证据。本文中4例血型不合的移植中，1例ABO血型21 d血型由原来的B型转变为AB型，77 d转变为A型（供者型）。1例ABO血型主要不合者于58 d转变为供者型。2例ABO血型次要不合者分别于49、83 d转变为供者型。血型转变直接证明了植入成功。但对于其他血型相合的Allo-HSCT，血型检测无法作为植入证据。②细胞遗传学分析:传统的细胞遗传学分析采用中期细胞分裂象检测标志染色体，但其仅适用于病人具有肿瘤的遗传学标记（如Ph+ 标记染色体）或供受者之间存在性别差异时。本文有4例供、受者性别不同，于移植后28 d送染色体检查，结果全部转为供者型。2例CML病人移植后Ph染色体消失。③分子遗传学分析:移植后供受者细胞间的关系可表现为供体细胞-受体细胞嵌合状态或供体细胞完全嵌合状态，分子遗传学分析正是利用这一嵌合状态，采用DNA分析技术进行移植后植入证据的检测。在本文中，所有Allo-HSCT的供、受者于7、14、21、28 d取外周血标本，提取DNA后，采用STR-PCR，鉴定供者造血干细胞在病人体内植入情况。结果14 d时STR-PCR检测9例转化为供者型，有1例仍为受者型;28 d时全 部转化为供者型（完全嵌合体）。GVHD是指在同种异基因造血干细胞移植后，由移植物中的抗原特异性淋巴细胞识别宿主组织抗原，进而对组织或器官进行攻击的复杂免疫应答过程，严重威胁移植后病人的生存质量，是导致异基因造血干细胞移植病人死亡的一个主要原因［2，3］。急性GVHD的发生与预处理方案有关。影响急性GVHD的危险因素是供者来源和HLA配型，无血缘关系的供者和HLA不合者较容易发生急性GVHD，且程度较重。由于急性GVHD的发生和严重程度显著影响预后，常需进行预防。临床中多采用细胞毒药物（如甲氨蝶呤等），免疫抑制剂（如环孢素A、ATG、FK-506等），单克隆抗体（如CD25、CD3单抗等），肾上腺皮质激素，甚至采取去除T细胞的方法预防急性GVHD的发生，以上各种方法的联合应用降低了GVHD发生的严重程度，但其发生率并没有明显改变。本组10例病人均采用经典的环孢素A联合短程甲氨蝶呤方案预防GVHD的发生，部分病人加用MMF，1例HLA半相合的病人加用ATG，结果均未出现超急性GVHD，本文有5例病人发生急性GVHD，均经应用甲基泼尼松龙、MMF、调整CsA剂量或由口服改为静滴并应用丙种球蛋白后很快控制。我们认为，对急性GVHD要强调预防和早期治疗，强化早期免疫抑制治疗，一旦控制后要尽快减量。已有学者证实糖皮质激素快速减量并不影响急性GVHD的复发和慢性GVHD的发生［4］。对于HLA半相合的Allo-HSCT，在预处理方案中应加强免疫抑制药物的使用，美国South Carolina大学报道210例HLA半相合的病人，在预处理中使用了ATG的病人平均植入时间为16 d，植入率高达97%，大大优于未使用ATG的病人。本文中的1例HLA半相合的病人，也加用了ATG，结果表明疗效确切，到目前为止已稳定植入，未发生急性GVHD。慢性GVHD可能是一种自身免疫性疾病，其发生可能与病人胸腺功能受破坏，使之不能对针对自身抗原的T细胞实行克隆清除有关［5］。王玫等［6］报道，异基因外周血造血干细胞移植的急性GVHD发生率与异基因骨髓移植相比无明显差异，但慢性GVHD的发生率（56.5%）明显高于异基因骨髓移植。国外有学者也证实了这一结果，并且发现异基因外周血造血干细胞移植比异基因骨髓移植复发率低，这可能与慢性GVHD的发生率高有关［7］。本文中10例病人Allo-HSCT后随访4～23个月，目前有6例发生慢性GVHD，其中2例发生于移植后8、10个月，已经停用CsA。由于大部分病人移植时间尚短，仍在继续随访。Allo-HSCT是治疗恶性血液病的有效手段，但HLA完全相合的供者来源严重不足，限制了异基因造血干细胞移植的开展。近年来，亲属间供受者HLA半相合骨髓-外周血造血干细胞移植已取得成功并获得较好效果。成功进行Allo-HSCT需要克服两个免疫屏障，即宿主抗移植物（HVG）反应和GVHD反应，供、受者之间的HLA免疫遗传学差异是引起HVG和GVHD的主要发病因素。供、受者之间的HLA差异越大，HVG和GVHD反应就越强烈。因此，与HLA相合移植相比较，HLA半相合移植面临植入失败率高、造血重建慢、GVHD重、免疫重建迟、致死性感染发生率高、移植相关病死率高等诸多障碍。由于经典预处理中没有采取足够的免疫抑制处理，在一定程度上导致了HLA半相合移植排斥。近年来，通常使用抗胸腺细胞免疫球蛋白、氟达拉滨、大剂量甲基泼尼松龙等免疫抑制性药物，或采用全身淋巴结照射以加强对受者的免疫抑制，以减少移植排斥的发生。本文中1例HLA半相合病人移植中，预处理采用了清髓性的Bu/Cy方案，在常规小剂量CsA联合短疗程甲氨蝶呤预防GVHD的基础上加用ATG，取得了良好的效果，造血重建迅速，28 d染色体、DNA检查显示完全植入，并且未发生急性GVHD。由于Allo-HSCT的移植物抗肿瘤作用，与自体 造血干细胞移植（Auto-HSCT）相比，Allo-HSCT具有复发率低的优势。尽管对于恶性淋巴瘤病人选择Allo-HSCT或Auto-HSCT仍有争议，不过我们所做的Auto-HSCT治疗预后不良的淋巴瘤也取得了很好的疗效［8］。

［参考文献］

　　［1］ CHAMPLIN R E， SCHMITZ N， HOROWITZ M M， et al. Blood stem cells compared with bone marrow as a source of hematopoietic cells for allogeneic transplantation［J］. Blood， 2000，95:3702-3709.

　　［2］ ROY J， BLAZAR B R. The tissue expression of cytokine in human acute cutaneous graft-versus-host disease［J］. Trans-plantation， 1995，60:343-348.

　　［3］ FERRARA J L M. Pradigm shift for graft-versus-host disease bone marrow［J］. Transplantation， 1994，14:183-184. 　　　　［4］ HINGS I M， FILIPOVICH A H， MILLER W J， et al. Pred-nisone therapy for acute graft-versus-host disease:short-ver-sus-long-term treatment. A prospective randomized trial［J］. Transplantation， 1993，56:577-580.

　　［5］ MACKALL C L， GRESS R E. Pathways of T-cell regenera-tion in mice and humans implications for bone marrow trans-plantation and immunotherapy［J］. Immune， 1997，157:61-72.

　　［6］ 王 玫，韩明哲，冯泗洲，等. 异基因外周血造血干细胞移植和异基因骨髓移植的临床疗效［J］.中华血液学杂志，1999，20（8）:427.

　　［7］ STEREK J H， GOOLEY T， SIADAK M， et al. Allogeneic peripheral blood stem cell transplantation may be associated with a high risk of chronic graft-versus-host disease［J］. Blood， 1997，12:705.

　　［8］ 史 春雷，袁成录，王玲，等. 自体造血干细胞移植对预后不良非霍奇金淋巴瘤的效果［J］.青岛大学医学院学报，2006，42（1）:67-68.