滑菇多糖对K562白血病细胞增殖的抑制及Caspase3基因表达的影响

作者:赵俊霞,郑力芬,赵娟,申园作者单位：河北医科大学基础医学院细胞生物学教研室，河北 石家庄 050017

     【摘要】  目的：研究滑菇多糖（PNP）的抗肿瘤作用及诱导K562细胞凋亡的机制. 方法：采用MTT法检测PNP对K562细胞增殖的抑制作用；绘制生长曲线；Hochest 33258染色计算凋亡率；RTPCR法、Western Blot方法检测凋亡相关基因Caspase3的表达. 结果：MTT分析表明，PNP作用48 h后可明显抑制K562细胞的增殖；Hochest染色结果显示，PNP能诱导K562细胞出现典型的凋亡形态，且凋亡率随多糖浓度增加而增大，经PNP 100，200，400 mg/L的处理后，凋亡率分别是对照组的3.15，6.55和8.62倍. PNP能诱导凋亡相关基因Caspase3在mRNA水平上的表达；Western Blot显示PNP能诱导Caspase3编码蛋白的表达，且随多糖浓度的增加表达量增加. 结论：PNP对K562细胞增殖有抑制作用， 并能促进其凋亡； PNP通过诱导凋亡相关基因Caspase3表达促进细胞凋亡.

【关键词】  滑菇多糖；K562细胞；白血病；增殖；凋亡；Caspase3基因

　　Effects of pholiota nameko polysaccharides on K562 leukemia cell proliferation and Caspase3 expression in vitro

　　ZHAO JunXia, ZHENG LiFen, ZHAO Juan, SHEN Yuan, WANG YanLing, YAN YunLi

　　Department of Cell Biology, Basic Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050017, China

　　【Abstract】 AIM: To investigate the antineoplastic effect of pholiota nameko polysaccharides (PNP) and the mechanism of inducing K562 cell apoptosis. METHODS: MTT assay was used to determine the inhibitory rate of PNP with different concentrations on the proliferation of K562 cells, and the cell growth curve was drawn. The cell apoptosis induced by PNP was detected under fluorescence microscope with Hoechst 33258 dye. RTPCR and Western Blot analysis were applied to test the expression of Caspase3 in K562 cells. RESULTS: MTT assay showed that the proliferation of K562 cells was inhibited apparently after treatment with PNP for 48 h; Hoechst staining showed the typical apoptotic features in K562 cells after induced by PNP, and the apoptosis rate increased along with the elevation of PNP concentration. The apoptotic rates of K562 cells treated by 100, 200, 400 μg/mL PNP were 3.15, 6.55 and 8.62 times as much as controls, respectively. PNP could promote the expression of Caspase3 at both mRNA and protein levels, and the gene expression also increased along with the rising of PNP concentration. CONCLUSION: PNP could inhibit the proliferation of K562 cells and induce apoptosis of the cells, maybe by upregulating the expression of Caspase3.

　　【Keywords】 pholiota nameko polysaccharides; K562 cells; leukemia; proliferation; apoptosis; Caspase3

　　0引言

　　近年来的研究发现，一些植物或真菌多糖除具有免疫增强作用外，对癌细胞还有直接抑制和杀灭作用［1］. 筛选具抗癌作用的天然多糖及研究多糖抗癌机制已成为目前肿瘤研究领域的热点之一. 滑菇是一种营养保健价值较高的食用菌. 有研究表明，滑菇多糖(pholiota nameko polysaccharide， PNP)除对小鼠S180细胞具有明显的抑制作用外，对正常以及荷瘤小鼠的免疫功能均有增强作用 ［2］. 但PNP对人白血病细胞K562增殖的抑制作用及诱导细胞凋亡的机制国内外均少见报道. 本研究通过观察PNP对K562细胞增殖的抑制作用和凋亡相关基因Caspase3的表达，旨在进一步探讨PNP的抗肿瘤作用及诱导K562细胞凋亡的机制　1材料和方法

　　1.1材料

　　RPMI1640培养基（美国Gibco公司）；噻唑蓝（MTT）（北京华美公司）；Hoechst 33258，一抗（Caspase3，βactin小鼠抗人抗体），二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IG）(美国Santa cruz公司)；PNP（河北师范大学生命科学院生化与分子生物学系王立安教授惠赠)；K562白血病细胞株（引自中国医学科学院血液病研究所）；倒置显微镜，荧光显微镜（日本Olympus公司）；CO2培养箱（日本Hitachi公司）；DYYⅢ 7B型电泳仪（北京六一仪器厂）；读胶仪AlphaImagerTM 1200型（美国ST公司）；PE480型DNA扩增仪（美国PE公司）；酶标仪ELX800（美国BioTek公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养采用含有100 mL/L血清，1×105 U/L青霉素，100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度环境下培养K562细胞.

　　1.2.2MTT检验取对数生长期的细胞，调细胞密度为1×108/L接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度环境下培养24 h后，对照组每孔加入100  μL无血清培养基，各实验组每孔加入100 μL用无血清RPMI1640培养基稀释的PNP，使终浓度分别为50，100，200和400 mg/L. 每个处理均做4个复孔. 继续培养48 h后，每孔分别加MTT 20 μL，再培养4 h，2000  r/min离心10 min，弃去上清，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，用酶标仪测490 nm的A值. 按如下公式计算：细胞增殖抑制率%=［（对照组A-实验组A）/对照组A］×100%.

　　1.2.3生长曲线的绘制调细胞密度为8×107/L接种于24孔培养板中，每孔加入1 mL细胞悬液，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度环境下培养24 h后，对照组每孔加1 mL无血清培养基，各实验组每孔加入1 mL用无血清RPMI1640培养基稀释的PNP，使终浓度分别为50，100，200和400 mg/L. 每个处理均做4个复孔. 在培养至24，48，72，96和120 h后，台盼蓝拒染. 血细胞计数器计算每毫升溶液中的活细胞数目，绘制生长曲线.

　　1.2.4Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡率细胞的前期处理同1.2.3. 48 h后，用PBS（pH 7.2）漂洗2次，调细胞密度约为1×109/L. 甲醇∶冰乙酸（3∶1） 4℃固定5  min，蒸馏水洗1次. 随后吸取少许滴加至干净载玻片上；室温干燥后，Hoechst 33258（5 g/L）染色. 30 min后蒸馏水漂洗除去染液，荧光显微镜观察照相. 镜下随机计数10个视野，按以下公式计算：细胞凋亡率%＝(凋亡细胞数/总细胞数)×100%.

　　1.2.5PNP对细胞凋亡相关基因Caspase3表达的诱导作用

　　1.2.5.1半定量RTPCR检测调细胞密度为1×108/L接种于60 mL培养瓶中，每瓶加入5 mL细胞悬液，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度环境下培养24 h后，对照组加5 mL无血清培养基，各实验组每瓶加入5 mL用无血清RPMI1640培养基稀释的PNP，使终浓度分别为50，100，200和400 mg/L. 继续培养48 h后，PBS洗涤2次. 采用Trizol法提取细胞总RNA，随机引物法合成cDNA. Caspase3基因引物：上游：5′GGAATTGATGCGTGATGT3′；下游：5′ACCAGGTGCTGTGGAGTA3′. βactin引物：上游：5′ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′；下游：5′ATCTTCAAACCTCCATGATG3′. 上述引物均由北京赛百胜公司合成. PCR扩增条件：95℃预变性10 min. Caspase3：95℃ 30 s, 50.1℃ 30 s, 72℃ 30 s，40循环，72℃延伸10 min；βactin：95℃ 30 s, 51.5℃ 30 s, 72℃ 30 s，30循环，72℃延伸10 min. 扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后，读胶仪读取扩增条带的吸光度值进行分析，以目标基因与βactin基因扩增产物的吸光度比值计算表达水平.

　　1.2.5.2Western印迹分析细胞的前期处理同1.2.5.1. 48 h后，PBS洗涤2次. 按照文献［3］的方法，提取细胞全蛋白，取50 μg进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，抗原抗体反应， ECL发光、显影. X光胶片扫描后，采用UVP lab work 4.60软件测定条带吸光度值，并分析结果. 以目标基因与βactin蛋白产物的吸光度比值计算表达水平.

　统计学处理：实验结果以x±s表示. 数据处理运用SAS 6.12统计软件，所用方法为单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1PNP对K562细胞增殖的抑制作用PNP作用K562细胞48 h后， PNP 50 mg/L浓度组抑制率为（9.45±1.76）%，明显高于对照组（P<0.05）；PNP 100，200和400 mg/L浓度组抑制率分别为（18.05±2.53）%，（20.30±2.35）%和（40.57±8.24）%，各浓度组抑制率与对照组相比较差异均具有统计学意义（P<0.01）. 经50 mg/L PNP处理后，细胞增殖受到抑制但增长趋势未受到明显影响；PNP 100 mg/L处理96 h后，可见活细胞数目明显下降，细胞死亡数目明显增加；经PNP 200和400 mg/L处理72 h后，即可观察到活细胞数目明显下降，细胞死亡数目显著增加（图1）.

　　2.2PNP对K562细胞凋亡的诱导作用对照组细胞细胞核界限清晰，呈圆形或椭圆形，为均匀蓝绿色荧光，染色质分布均匀（图2A）. PNP处理后的细胞，部分细胞细胞核缩小，染色质凝集呈颗粒团状分布，有的核碎裂形成多个球形颗粒（图2B）. 图3显示，经PNP 100  mg/L处理后，凋亡率是对照组的3.15倍，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；经PNP浓度为200，400 mg/L处理后，K562细胞凋亡率分别是对照组的6.55倍和8.62倍，差异有统计学意义（P<0.01）.

　　2.3PNP对细胞凋亡相关基因Caspase3的诱导作用

　　2.3.1PNP对细胞凋亡相关基因Caspase3 mRNA水平的影响不同浓度的PNP作用K562细胞48 h后，βactin基因的RTPCR产物（115 bp带）几乎保持不变，但Caspase3基因的RTPCR产物（350 bp带）随着PNP处理浓度的增大明显增多，电泳条带变宽、变亮（图4）. 计算结果显示，对照组为0.90±0.05，100 mg/L浓度组为1.07±0.04，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；200，400 mg/L浓度组分别为1.27±0.04和1.75±0.03，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）.

　　2.3.2PNP对细胞凋亡相关基因Caspase3蛋白表达的影响βactin基因的表达产物经不同浓度PNP处理后几乎保持不变，但Caspase3基因的表达产物随着PNP处理浓度的增大明显增多，电泳条带变宽（图5）. 计算结果显示：对照组为0.040±0.003；100 mg/L浓度组为0.077±0.008，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；200，400 mg/L浓度组分别为0.212±0.005和0.249±0.007，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01）.

　　3讨论

　　食用菌多糖的抗肿瘤作用主要是通过两种途径实现的，一是具有细胞毒性的多糖直接杀死了肿瘤细胞，这类多糖有灰树花多糖、姬松茸多糖、正红菇子实体多糖等；二是作为生物免疫反应调节剂通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞，如促进杀伤细胞(LAK)活性、诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子［6］.　　　　本研究结果表明，PNP对人K562细胞的增殖具有抑制作用并能诱导其凋亡，且抑制率、凋亡率随PNP浓度增加而增大. 可能的原因是通过诱导部分细胞脱离了细胞周期，进入凋亡状态，与肿瘤的发展有密切的关系. Caspases3被激活后可使癌细胞发生凋亡，我们的实验结果表明了PNP能诱导凋亡相关基因Caspase3的表达，且随多糖浓度的增加基因表达量增加. 提示K562细胞凋亡机制的启动与Caspase3的表达密切相关. 与余晓林等［4］报道的Caspases3基因对肝癌细胞等具有明显促凋亡作用，并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡；贾林涛等［5］研究报道的Caspases3对HeLa 细胞的凋亡具诱导作用的结论相一致. 这提示PNP可作为治疗白血病的潜力药物. 由于我们的实验结果是在离体的状态下取得的，对其潜在价值的评判还需取决于活体实验的效果，这方面的工作我们正在进行之中.

【参考文献】  　　［1］李建恒，张杏红. 抗肿瘤中药多糖研究进展［J］. 中医药学报，1998,4:46-48.

［2］宋玉光, 李庆章, 高学军. 滑菇多糖对荷瘤及正常小鼠免疫功能的影响［J］. 食用菌, 2002,6:40-42.

　　［3］温进坤，韩梅. 医学分子生物学理论与研究技术［M］. 北京：科学出版社, 2002：225-232.

　　［4］余晓林, 刘红, 陈万平, 等. GFP共表达的重构型Caspase3基因对Hep2细胞的作用［J］. 第四军医大学学报, 2005,26(21):1945-1947.

　　［5］贾林涛,于翠娟,许彦鸣,等. Caspases3融合蛋白基因的构建及其对HeLa细胞凋亡的诱导作用［J］ 第四军医大学学报,2001,22(12):1057-1060.

　　［6］赵桢. 细胞凋亡的研究进展［J］. 现代医药卫生, 2004,20(13):1234-1235.