沙培林诱导脐血树突状细胞的成熟

     摘要:目的改进体外诱导脐血树突状细胞(DC)成熟的方案,为后期制备临床使用的抗肿瘤DC疫苗提供新的技术路线。方法分离脐血单个核细胞(CBMC)并在含10%同源脐血浆、重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)和重组人白细胞介素4(rhIL4)的培养体系中诱导培养,部分加入肿瘤冻融抗原和/或沙培林(OK432)冲击,光镜和电镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测培养前后各组细胞表面抗原CD1a和CD83的表达情况。结果培养过程中,细胞形态发生明显变化,呈现典型的DC形态。收集第9天各组DC,细胞表面均高度表达CD1a和CD83,与贴壁分离的CBMC比较有统计学意义,肿瘤冻融抗原冲击后,DC表面CD1a和CD83的表达上调,沙培林进一步刺激后,CD1a和CD83表达率显著升高。结论诱导脐带血来源的前体细胞分化为未成熟DC的途径相对简便；沙培林能促进肿瘤冻融抗原冲击后的脐血DC进一步成熟。

    关键词:树突细胞; 胎血; 沙培林(non MESH)

     树突状细胞(DC)是目前所知体内功能最强的抗原呈递细胞,具有打破肿瘤免疫耐受并激发特异性肿瘤免疫继而抑制肿瘤发展的能力。随着DC的体外培养扩增技术的日益成熟,肿瘤DC疫苗作为肿瘤免疫治疗的新方法,显示了良好的抗肿瘤前景[13]。由于患者免疫功能处于抑制状态,临床应用时通常难以从患者骨髓或外周血获得相应足够数量的前体细胞用于诱导培养DC。脐血含有丰富的造血干细胞,免疫原性相对较弱且来源广泛,采集方便,可作为抗肿瘤DC疫苗前体细胞的重要来源。笔者采用链球菌制剂――沙培林诱导联合肿瘤细胞冻融抗原冲击促进DC成熟的方法,研制脐血单个核细胞来源的DC,并分别从形态学和细胞表型方面进行鉴定。

    1材料与方法

    1.1材料RPMI 1640培养基(美国GIBICO公司)。重组人白细胞介素4(rhIL4,美国R&D公司)。重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF,厦门特宝生物公司)。胎牛血清(杭州江滨生物技术公司)。淋巴细胞分离液(中科院天津灏洋生物制品公司)。单克隆抗体包括异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD1a和CD83及FITC标记的同型IgG1(美国Ancell公司)。沙培林(OK432,山东鲁抗制药公司)。

    1.2方法

    1.2.1制备人胃癌细胞冻融抗原参照文献[3],常规培养人胃癌细胞株SCG7901细胞,制成1×107mL-l的细胞悬液,-20~37 ℃反复冻融4次,离心收集上清液,过滤,-20 ℃保存备用。

    1.2.2获取脐血单核细胞参照文献[46]并略加修改。健康产妇足月分娩断脐,抽取胎盘脐带血30~50 mL,肝素20 IU/mL抗凝。将稀释的脐血轻轻加于淋巴细胞分离液上面,2 000 r/min离心20 min,分离血浆及白膜层细胞,洗涤后,用含10%自体脐血浆的RPMI 1640液调整细胞浓度为2.5×106mL-1培养孵育2 h,吸去悬浮的细胞,所得的贴壁细胞即脐血单个核细胞（CBMC）。

    1.2.3体外诱导分化脐血DC经贴壁分离的CBMC置于含10%自体脐血浆的RPMI 1640完全培养液中继续培养,并加入GMCSF(1000 IU/mL)、IL4(500 IU/mL)置于培养箱中培养孵育9 d,每3天换液一次并补加细胞因子。将培养的DC分为3组,其中2组于培养第6天加入胃癌细胞冻融抗原冲击使CBDC捕获并处理抗原(按制备冻融抗原前的肿瘤细胞数量与DC数量3∶1的比例加入肿瘤抗原)8~16 h后给这两份细胞换液,并给其中一组加入沙培林5 μg/mL,继续培养48 h,分别收集3组细胞:(1)以未经抗原冲击的DC为CBDC组;(2)经肿瘤抗原冲击的DC为TLDC组;(3)肿瘤抗原冲击后加入沙培林进一步促进其成熟的DC为OKDC组。

    1.2.4细胞形态观察每日用倒置显微镜直接观察细胞形态并拍摄照片。培养9 d后收集成熟DC,3%戊二醛1.5%多聚甲醛前固定(4 ℃),1%锇酸1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h,PBS漂洗;70%乙醇饱和醋酸铀染液块染,乙醇丙酮梯度脱水,环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片80 nm,醋酸铀、枸橼酸铅染色各5 min。透射电镜观察、摄影。福建医科大学学报2006年7月第40卷第4期倪秀雄等：沙培林诱导脐血树突状细胞的成熟

    1.2.5表型检测分别收集诱导前的CBMC和3组悬浮细胞,PBS缓冲液洗涤,调整细胞浓度7×106mL-1,每组细胞分成3份,分别加入直接荧光标记抗体FITCCD1a、FITCCD83及同型阴性对照。4 ℃避光孵育45 min,PBS洗涤,重新悬浮细胞,流式细胞仪分析104个细胞分布及抗原表达情况。

    1.2.6统计学处理数据以x±s表示。数据处理采用SPSS 11.5软件包。采用单因素方差分析,SNKq检验对数据进行两两比较,以P<0.05表示有统计学意义。

    2结果

    2.1DC形态观察

    2.1.1光镜CBMC经诱导3~4 d后,倒置显微镜下可见部分细胞聚集呈散在的细胞集落,多数细胞悬浮,细胞体积逐渐增大,表面有毛刺状突起。培养第9天,细胞体积明显增大,部分细胞贴壁,形状不规则,细胞质丰富,有粗大树突状突起,部分圆形细胞均匀分布于培养液中,细胞质透亮,表面毛刺状突起。背景可见少量长梭形细胞,为伸展的巨噬细胞(图1)。

    2.1.2电镜细胞表面有大量皱折和细长的分支样突起,细胞质含有丰富的线粒体和少量溶酶体,可见粗面和滑面内质网及高尔基体,细胞核大不规则,呈偏位(图2)。

    2.2细胞表型分析贴壁的CBMC在不同条件下诱导9 d,均可诱导出DC,各组细胞表面高度表达DC相对特异性标志CD1a和CD83,与CBMC相比有统计学意义。肿瘤冻融抗原冲击后,DC表面CD1a和CD83的表达上调,但CD1a的表达与CBDC比较差别无统计学意义,用沙培林进一步刺激后,CD1a和CD83表达率显著升高(P<0.05,图3,表1)。

    由左至右依次为贴壁分离的脐血单个核细胞、诱导分化为脐血树突状细胞、经肿瘤抗原冲击的树突状细胞和沙培林联合抗原冲击为成熟树突状细胞,上为CD1a,下为CD83,各组采用相同对照(未显示)

      3讨论

    在实际治疗过程中，尤其对于某些晚期肿瘤患者,无论是采集外周血单个核细胞还是骨髓CD34＋细胞,较难获取足量的DC,而脐血含有丰富的造血干细胞,免疫原性相对较弱,来源广泛,采集方便,有望成为DC疫苗制备的重要补充,目前对以脐血CD34＋细胞为前体细胞的DC疫苗有较深入的探讨,而有关CBMC来源的DC报道较少[6]。

     DC的体外诱导多采用含胎牛血清的培养体系,由于胎牛血清本身具有免疫原性,不同批次的活性存在较大差异等原因,使该方法培养的DC疫苗的临床应用受到了限制。Piemon等分别使用10%胎牛血清、2%同源人血清、2％同种异源人AB型血清培养DC,发现各组培养获得的DC形态典型、数量无明显差异;表面特异性标志检测在同源人血清条件下培养的DC甚至比胎牛血清条件下培养的DC更为成熟;用CD40L诱导成熟的各组DC刺激同源T细胞增殖的能力无明显区别[1]。与成人血清相比,脐血清更富含丰富的细胞因子,曾有报道称脐血清中SCF、GMCSF、GCSF、IL6和TNF等多种细胞因子的含量远高于人外周血清[7]。笔者采用同源脐血浆取代胎牛血清,既避免了异种抗原的应用,又充分利用了脐血浆中丰富的细胞因子,具较大的实用价值。

    DC的成熟状态是决定其有效呈递抗原和疫苗疗效的关键因素。体外诱导DC成熟常需联合使用多种细胞因子,尤其是在培养脐血来源的DC中TNFα似乎更是必不可少,这些因子价格昂贵,且会导致患者发热[5,811]。由于目前常用的体外诱导DC成熟的制剂LPS、TNFα联合PGE2,不适合肿瘤临床治疗,需要寻找新的DC成熟诱导剂。OK432作为GMP级的免疫调节剂和处方药,在日本用于治疗各种肿瘤已有20年的历史,它是链球菌Su株细胞壁成分的冻干制剂,具有激活多种免疫效应细胞的作用,作为一种安全,有效的免疫调节剂可提高恶性肿瘤患者的生存率,延长存活期。Itoh等发现与常用的DC成熟诱导剂LPS、TNFα相比，OK432刺激健康人外周血单个核细胞来源的未成熟DC(imDC)成熟的能力更强,同时促进DC分泌TNFα、IL12、IFNγ等细胞因子,增强DC呈递抗原和激发特异性CTL反应的能力[45,8,11]。沙培林是国产的OK432同类产品,本组实验结果显示,用脐血浆取代胎牛血清在仅含IL4和GMCSF的培养体系中可诱导脐血单个核细胞向DC分化,高度表达DC相对特异性标志CD1a和CD83,肿瘤冻融抗原冲击后细胞向成熟方向分化,而沙培林联合肿瘤冻融抗原作用下的DC CD1a和CD83的表达率最高,说明该组DC最为成熟。笔者将进一步观察DC抗原呈递能力,并检测它对杀伤性T淋巴细胞功能的影响。

    脐血浆含有丰富的细胞因子,能辅助GMCSF和IL4诱导CBMC向DC分化,避免不适宜临床应用的胎牛血清的使用;在相同培养时间内联合应用沙培林诱导的DC与仅用肿瘤冻融抗原冲击的DC相比,前者更为成熟。本文疫苗制备方案不需要大量昂贵的重组人细胞因子,节省疫苗研制的费用,缩短DC成熟的时间,如果进一步的功能学研究证明这种方法制备的肿瘤疫苗有增强肿瘤免疫的作用,则该制备方案有临床应用价值。

    参考文献：

    [1]Piemonti L,Monti P,Zerbi A,et al. Generation and functional characterization of dendritic cells from patients with pancreatic carcinoma with special regard to clinical applicability[J]. Cancer Immunol Immunother, 2000,49(10):544550.

    [2]Kuroki H,Morisaki T,Matsumoto K,et al. Streptococcal preparation OK432:a new maturation factor of monocytederived dendritic cells for clinical use[J]. Cancer Immunol Immunother, 2003,52(9):561568.

    [3]Yu JS,Liu G,Ying WH,et al. Vaccination with tumor lysatepulsed dendritic cells elicits antigenspecific,cytotoxic Tcells in patients with malignant glioma[J]. Cancer Res, 2004,64(14):49734979.

    [4]Itoh T,Ueda Y,Okngawa K,et al. Streptococcal preparation OK432 promotes functional maturation of human monocytederived dendritic cells [J]. Cancer Immunol Immunother, 2003,52(4):207214.

    [5]Nakahara S,Tsunoda T,Baba T,et al. Dendritic cells stimulated with a bacterial product,OK432,efficiently induce cytotoxic T lymphocytes specific to tumor rejection peptide[J]. Cancer Res, 2003,63(14):41124118.

    [6]刘崇东,王枚,张震宇,等. 脐血树突状细胞的体外培养及免疫学特征[J].中国实验诊断学, 2004,8(3):260262.

    [7]Opsjln SL,Wathen NC,Tingulstad S,et al. Tumor necrosis factor,interleukin1,and interleukin6 in normal human pregnancy[J]. Am J Obstet Gynecol,1993,169(2 Pt 1):397404.

    [8]Tamada K,Harada M,Abe K,et al.Antitumor vaccination effect of dendritic cells can be augmented by locally utilizing Th1type cytokines from OK432reactive CD4+T cells[J]. Cancer Immunol Immunother, 1998,46(3):128136.

    [9]Mashino K,Sadanaga N,Tanaka F,et al. Effective strategy of dendritic cellbased immunotherapy for advanced tumorbearing hosts: the critical role of Th1dominant immunity[J]. Mol Cancer Ther, 2002,1(10):785794.

    [10]Oksmoto M,Furuichi S,Nishioka Y,et al. Expression of Tolllike receptor 4 on dendritic cells is significant for anticancer effect of dendritic cellbased immunotherapy in combination with an active component of OK432,a streptococcal preparation[J]. Cancer Res, 2004,64(15):54615470.

    [11]Ogihara T,Iinuma H,Okinaga K. Usefulness of immunomodulators for maturation of dendritic cells[J]. Int J Oncol, 2004,25(2):453459.