干扰素α、5-AZA-CdR对白血病细胞HL-60和K562的作用

        凋亡（apoptosis）是受基因调控的细胞固有的主动消亡过程，在维持组织稳态中起着极其重要的作用，细胞凋亡受阻是导致肿瘤发病和耐药的主要病理学基础之一。凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis，IAPs）家族是目前已知的唯一的内源性凋亡执行者-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteine aspartate-specific protease，Caspase）的抑制物，其中XIAP（X-chromosome-linked inhibitors of apoptosis）的作用最强有力[1]。最近从酵母双杂交系统中获得了一种XIAP负调节蛋白-Xaf1（XIAP-associated factor 1），能直接结合XIAP而阻断后者抗Caspase的活性[2]。IAPs在白血病等多种恶性肿瘤中过度表达[3，4]，相反，Xaf1广泛表达于所有的正常组织中，但在NCI 60种肿瘤细胞株中表达很低或不能检测到[5]。Xaf1降低不能拮抗XIAP抗凋亡的活性，细胞存活几率增加可能导致了肿瘤的发生[6]，通过增加XIAP内源性拮抗剂Xaf1的表达是一个新的癌症治疗靶点。基因工程可以增加肿瘤细胞Xaf1表达并诱导其凋亡[7]，但是由于其靶向性差、转染率低、导致基因突变等具体技术问题尚未解决，限制了临床应用。应用化疗药物干扰素（interferon，INF）和5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-AZA-CdR）[8，9]诱导其表达并促进凋亡可能更切实际。它们是否能在白血病细胞中诱导Xaf1表达尚未见报道。本文通过单独和联合INFα和5-AZA-CdR作用于髓系白血病细胞株HL-60和K562，探讨其作用机制。

    1   材料与方法

    1.1   细胞株和主要试剂

    HL-60和K562细胞株分别来自中山大学肿瘤防治中心和中山大学动物实验中心。200 mL/L胎牛血清（FCS）购自杭州四季青公司，DMEM低糖型细胞培养液购自Gibco公司。TRIzol Reagent购自Invitrogen公司，ReverTra DashTM RT-PCR Kit和Taq酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司鉴定和合成。Bcl-2、Bcl-xl和Bax抗体购自美国Southern Biotech公司和Labvision公司。JC-1购自美国Sigma公司。Annexin V-FITC/kit细胞凋亡检测试剂盒购自Caltag Laboratoyies公司。IFNα购自美国Sigma公司。5-AZA-CdR购自美国Merck公司。

    1.2   细胞培养

    髓性白血病细胞株HL-60和K562常规悬浮培养于含10%热灭活（56 ℃，30 min）FBS的DMEM低糖型细胞培养液（pH 7.2～7.4），置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱中，每2～3 d传代1次。

    1.3   药物处理

    每孔接种5×105个细胞，分为空白对照组、IFNα组、不同浓度5-AZA-CdR组以及IFNα和5-AZA-CdR联合作用组（共6组），终浓度分别设置为IFNα 1 000 U/mL、5-AZA-CdR 1 μmol/L和5 μmol/L。经上述药物处理48 h后，离心收集细胞备用。

    1.4   RT-PCR检测

    TRIzol提取细胞总RNA，在10 g/L琼脂糖凝胶电泳下见3条清晰的条带（28 S、18 S、5 S），并用紫外分光光度计检测260 nm和280 nm的吸光度值，计算总RNA的浓度和纯度。根据ReverTra DashTM RT-PCR Kit提示20 μL逆转录体系含总RNA 2 μL、随机引物1 μL、RNase Free H2O 9 μL、5× RT Buffer 4 μL、dNTP Mixture 2 μL、RNase Inhibitor 1 μL、ReverTra Ace 1 μL，42℃ 20 min，99 ℃ 5 min灭活逆转录酶，获得cDNA保存于-20 ℃。取10 μL cDNA、系列特异性上、下游引物各0.5 μL和KOD Dash 1 μL等50 μL反应体系进行PCR扩增，条件94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35次循环后72 ℃ 10 min延长。产物经SYBR GREEN I染色后10 g/L琼脂糖凝胶电泳（80 V、40 min），紫外灯下照相，并用凝胶成像分析系统进行半定量分析，以相关基因与内参照G3PDH的比值代表其mRNA水平。Xaf1上游引物5′TCC GGA ATT CAT GCT CCA CGA GTC CTA CTG 3′；下游引物5′ACG CGT CGA CAA ACT CTG AGT CTG GAC AAC 3′，PCR产物为260 bp。XIAP上游引物5′GAA GAC CCT TGG GAA CAG CA 3′；下游引物5′CGC CTT AGC TGC TCT TCA GT 3′，PCR产物为380 bp。内参照G3PDH上游引物5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3′；下游引物5′TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3′，PCR产物为450 bp。

    1.5   流式细胞检测

    1.5.1   Bcl-2家族成员   收集1×106/mL细胞用PBS洗涤2次后重悬为50 μL，加入100 μL FIX&PERM试剂A液，室温放置15 min，PBS洗涤1次，再加入100 μL FIX&PERM试剂B液,分别加入10 μL相应抗体摇匀，4 ℃避光放置20 min，PBS洗涤2次，0.5 mL PBS重悬，细胞仪检测。

    1.5.2   线粒体膜电位   收集（1～2）×106/mL细胞用1 mL 37 ℃培养液重悬，加入5 μL 1 mg/mL JC-1充分混匀，37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中避光孵育20 min，离心去除上清并用PBS洗涤两次，重悬后取少量细胞悬液涂片在荧光显微镜下观察，其余送流式细胞仪检测。

    1.5.3   细胞凋亡   收集1 × 106/mL细胞用PBS洗涤2次，用稀释的结合缓冲液重悬为(2～5)×105/mL，195 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC混匀，室温孵育10 min，PBS洗涤1次，再用190 μL结合缓冲液重悬，加入10 μL PI，细胞仪检测。

    1.6   统计学处理

    计量资料以（ｘ±ｓ）表示,采用SPSS 13.0统计软件进行方差齐性检验、单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用q检验（Newman-Keuls法），检验水准α=0.05。

    2   结   果

    2.1   Xaf1、XIAP mRNA的表达

    单独用INFα和5-AZA-CdR处理白血病细胞HL-60和K562 48 h可见Xaf1 mRNA表达增加，且与5-AZA-CdR呈剂量依赖性，三者中5-AZA-CdR（5 μmol/L）作用最明显。联合应用INFα和5-AZA-CdR，Xaf1 mRNA的表达亦增加，但与相同剂量的5-AZA-CdR比较无显著性差异（P >0.05）。单独和联合应用INFα和不同剂量的5-AZA-CdR，HL-60和K562细胞XIAP mRNA的表达无明显变化。

    2.2   Bcl-2家族成员的改变

    INFα不影响HL-60细胞Bcl-2和Bcl-xl的表达，而使Bax的表达增加。而5-AZA-CdR使Bcl-2和Bcl-xl的表达降低，并具有剂量依赖性；同时也降低Bax的表达。二者联合可使HL-60的Bcl-2和Bcl-xl的表达更低，Bax的表达亦降低，但与相同剂量的5-AZA-CdR比较无显著性差异（表1）。

    K562细胞Bcl-2表达很低，而Bcl-xl高表达。INFα或不同剂量的5-AZA-CdR不改变Bcl-xl的表达，却明显提高Bax的表达，三者中以INFα的作用最明显；二者无协同作用（表2）。

    2.3   跨膜电位的影响

    INFα和5-AZA-CdR可使HL-60和K562细胞线粒体膜电位降低，胞浆内的绿色荧光增加，二者并无协同作用（图1）。

    2.4   细胞凋亡的影响

    INFα和不同剂量的5-AZA-CdR均能使HL-60和K562细胞凋亡，并随着5-AZA-CdR剂量增加，肿瘤细胞凋亡增多；INFα和5-AZA-CdR对HL-60和K562细胞都具有协同作用（表1、2）。

    3   讨   论

    凋亡异常与肿瘤等多种疾病的发生密切相关，由于凋亡抑制蛋白的减少或缺失，和/或亲凋亡蛋白过度表达，细胞凋亡受阻则导致了恶性肿瘤的发生。Xaf1和XIAP是一对相互作用的凋亡调节蛋白，在血液系统恶性肿瘤中普遍存在Xaf1低表达或/和XIAP高表达的失调，逆转Xaf1/XIAP的异常状态可以作为血液系统肿瘤治疗的策略。Fong等[5]在K562细胞中基本上检测不到Xaf1 mRNA，而XIAP mRNA高表达；相较在HL-60细胞中存在Xaf1 mRNA表达，略低于XIAP mRNA表达。我们希望在这两种Xaf1和XIAP表达状态不同的白血病细胞株中，是否都可以通过改变Xaf1/XIAP的比例而达到凋亡诱导的目的？

    Xaf1作为新发现的干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes,ISGs）[8]可以上调Xaf1 mRNA的表达，并致敏人类黑素瘤细胞对TRAIL/Apo2L诱导的凋亡[10，11]，本实验证实INFα可以诱导HL-60和K562 Xaf1表达。在胃肠道肿瘤细胞中Xaf1低表达或表达缺失可能与基因甲基化有关[9]。目前已应用于临床试验的5-AZA-CdR（5-aza-2-deoxycytidine）是特异的DNA甲基化转移酶抑制剂，不参与RNA和DNA的合成，通过与DNA甲基化转移酶形成共价键而使后者失活，恢复DNA的低甲基化状态，有利于基因转录和蛋白质表达。实验中不同剂量的5-AZA-CdR也可使HL-60和K562细胞的Xaf1 mRNA表达增加，且Xaf1表达与5-AZA-CdR呈剂量依赖性；5-AZA-CdR的作用优于INFα，二者不具有协同作用。单用或联合INFα和5-AZA-CdR都不改变它们XIAP mRNA的表达。推测INFα和5-AZA-CdR可以通过增加Xaf1的表达，逆转Xaf1/XIAP的比例，拮抗XIAP抗Caspase的作用而诱导这两种白血病细胞凋亡。

    细胞凋亡中线粒体有着举足轻重的作用，其跨膜电位（Δψm）下降致细胞色素C和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）释放，Caspase-9活化细胞死亡。Bcl-2家族成员主要是通过调节线粒体内外膜的通透能力或稳定屏障功能而实现其凋亡调节的作用。本实验发现INFα对HL-60和K562 Bcl-2家族的调节作用相同，不影响Bcl-2和Bcl-xl而增加Bax的表达。5-AZA-CdR对HL-60和K562的作用机制却是不同的，前者的Bcl-2、Bcl-xl、Bax表达都降低，Bcl-2和Bcl-xl的下降更明显；后者的Bcl-2和Bcl-xl不受影响而Bax增加。它们最终均改变了抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和亲凋亡蛋白Bax的比例，使线粒体膜电位降低，细胞凋亡增加。

    JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide）是一种荧光染料，它能渗透到细胞内与线粒体特异性结合。在正常的细胞内线粒体膜电位高，JC-1聚集于线粒体中形成多聚体呈红色荧光，此时激发波长为488 nm，发射波长为590 nm；在凋亡细胞中线粒体膜电位降低，JC-1不能聚集在线粒体内，而以单体形式存在于胞浆中呈绿色荧光，此时的激发波长是488 nm，发射波长是527 nm。JC-1与若丹明123（Rhodamin123）比较能更好地反映线粒体膜电位的变化[12]。本实验显示INFα和5-AZA-CdR作用于HL-60和K562细胞后呈绿色荧光的细胞增多，经流式细胞仪检测绿色荧光增加，红色荧光减弱。

    INFα和5-AZA-CdR对HL-60和K562 Xaf1 mRNA的表达、Bcl-2家族成员的调节以及线粒体膜电位的降低都没有协同作用，却能协同促进细胞凋亡，说明还存在其它作用位点，这有待进一步研究。