干细胞治疗脑血管病后遗症临床疗效观察

作者　          　作者单位

李铭         710054　西安，解放军第323医院细胞治疗中心

王黎明       710054　西安，解放军第323医院细胞治疗中心

周建军       710054　西安，解放军第323医院细胞治疗中心

白雯         710054　西安，解放军第323医院细胞治疗中心

钟占强       710054　西安，解放军第323医院细胞治疗中心

王汉裕       中国医学科学院血液学研究所 血液学国家重点实验室

刘拥军       中国医学科学院血液学研究所 血液学国家重点实验室

脑血管病(cerebral vascular disease，CVD)是指各种病因使人脑血管发生病变，造成颅内血液供应障碍，从而引起脑组织损害的一组疾病。急性CVD一般分为缺血性和出血性2类。该病多见于中老年人，常引起肢体瘫痪、语言障碍、智力下降，严重者呈植物人状态，甚至死亡。神经细胞损伤后难以再生修复，以致神经系统损伤后的临床症状难以改善。目前临床治疗CVD后遗症的方法包括改善脑血液循环、促进脑代谢、使用脱水剂等药物，但均不能保证病变区脑神经细胞的修复。随着干细胞工程的推进，细胞再生、修复治疗已成为治疗损伤、遗传缺陷、退行性疾病的新途径，我科采用的经外周血单采纯化的CD34+干细胞及脐带间充质干细胞对此类患者进行治疗，报道如下。

一、资料与方法

1. 一般资料：选择解放军第323医院细胞治疗中心2008年10月至2010年4月收治的患者17例，根据临床表现和头部CT和MR确诊，经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意，采用干细胞治疗。排除脑积水、癫痫、大面积脑梗死及植物状态病例。男12例，女5例，年龄中位数57岁，病程1～9年。其中脑出血后遗症10例，脑梗死后遗症7例。17例随机分为A、B组，A组：9例，采用自体分选造血干细胞，男7例，女2例，均<60岁，中位数48岁，病程1～7年，患者均无高血压、糖尿病、冠心病等基础病，可耐受细胞动员剂及外周血干细胞采集，采用Barthel指数(BI)评分[1]为0～95分，平均50分。B组：8例，采用脐带间充质干细胞治疗，男5例，女3例，年龄均>60岁，中位数67岁，病程1～9年，患者至少患有高血压、糖尿病、冠心病等一种基础疾病，无法耐受细胞动员剂及外周血干细胞采集，BI评分0～70分，平均55分。

2. 干细胞的制备：自体分选造血干细胞制备[2]：重组人粒细胞刺激因子(G-CSF)150～300 μg(华北制药生产，批号200903Y21)/d1～3(指第1～3天)皮下注射，用COBE血细胞分离机采集外周血100～120 ml;CD34+干细胞经Clini MACS仪器免疫磁柱分选，获得(1.0～5.6)×107的CD34+细胞，流式细胞仪检测阳性率为85%。将部分CD34+细胞分离液加入细胞保养液(CP-I)中，并放入-80℃冰箱冻存，以备后续治疗用。脐带间充质干细胞制备[3]：采集新生儿脐带(由三级甲等医院妇产科提供)，将脐带剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm，经0.1%胶原酶和0.125%的胰酶37 ℃分别消化30 min，先后用100目及200目滤网过滤，去除未消化的组织。过滤后的细胞按1×106/cm2接种于塑料培养瓶，用含DMEM-LG/F12(Sigma，USA),5%FCS(Gibco BRL，USA)的培养基，置37 ℃，体积分数为0.05的CO2培养箱培养，4～5 d后换液，弃非贴壁细胞，以后每3～4 d半量换液。待细胞80%融合，0.25%胰酶(Sigma，USA)消化，按1×104/cm2传代。贴壁细胞常规消化后，以FITC标记的CD105(SH2)、CD44抗体及其相应同型对照标记细胞，流式细胞仪(FACA Calibur型，USA)检测。获得(1.0～5.6)×107的UC-MSC，流式细胞仪检测阳性率为95%。

3. 治疗方法：2组17例患者均在局麻下行腰椎穿刺蛛网膜下腔注入干细胞，4 ml/次(细胞数量1×107),1周注射1次，注射4次为1个疗程;其中脐带间充质干细胞治疗时，需静脉给予地塞米松2～5 mg。治疗后患者加强功能康复训练。

二、结果

1. 治疗结果：治疗后2个月随访17例患者均有不同程度疗效，主要表现在吃饭、移动、活动、穿衣、上楼梯等方面。A组治疗后患者BI评分提高0～20分，平均11分;B组BI评分提高5～15分，平均8分。年龄小、病程短的患者较年龄大、病程长的患者提高的幅度大;治疗前评分低的患者治疗后临床症状改善明显。A组2例治疗前整体生活能力尚可，治疗后2个月BI评分提高不明显，性别与结果无相关性(图1)。随访17例患者4～22个月，无头痛、发热等不良反应，体力、精神、饮食较前有所好转，能配合适合个体的康复训练，原患有的慢性疾病病情平稳，B组患有高血压、糖尿病、冠心病等基础病的患者治疗后发现基础病较治疗前在血压、心功能等方面有一定改善，基础用药剂量无增加，并有逐渐递减的趋势。

2. 安全评估：A组在2次干细胞治疗后，2例出现低颅压症状，补充0.9%氯化钠500 ml 后症状均消失;B组患者治疗24 h后出现低颅压症状1例，给予补充0.9%氯化钠500 ml后症状消失，2例干细胞治疗后2～3 h出现发热，体温37.5～38.0 ℃，4 h内可自行消退，未用过退热药。脐带间充质干细胞来源于废弃的脐带组织，其抗原性低，不同于脐血干细胞需配型。治疗后2个月17例患者复查血常规、肝功能、肾功能均正常，均无其他不良反应。

三、讨论

成体中枢神经再生能力有限，损伤后不能自发修复。自1992年Revnokls等首次从成年鼠分离培养出干细胞后，大量研究发现，成年动物和人的中枢神经系统的多个部位均存在干细胞，具有自我增殖和多向分化潜能，能分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞[4]。Kin等分别在鼠缺血性脑损伤的对侧脑实质内或脑室内移植干细胞。发现移植细胞的迁移范围，后者较前者更大。故认为在早期的缺血性脑损伤中，脑脊液内应用移植细胞能更有效地播种在损伤部位。脑出血后，由于脑内血肿的占位压迫和手术操作的损伤，均可使部分脑组织受损，表现为局部血液循环障碍、神经细胞坏死、神经网络局部缺损、血脑屏障破坏，并由于水肿、缺血、毒素吸收等情况病灶周围健存神经细胞进一步遭到损伤。移植的干细胞识别病灶部位并选择性地向病灶移动，相对密集地聚集在病灶中心及周边，通过细胞替代或分泌营养物质等方式促进损伤神经功能的恢复[5]。目前国外有报道采用骨髓间充质干细胞治疗CVD后遗症[6-7]，未见应用自体分选CD34+干细胞及脐带间充质干细胞治疗该病的报道。我细胞治疗中心采用自体分选CD34+干细胞及脐带间充质干细胞经腰椎穿刺蛛网膜下腔注入的方式，同时加强患者功能康复锻炼，取得了较好的疗效，干细胞治疗2个月后，对17例患者进行BI评分，均有提高，A组平均提高11分，B组平均提高8分，主要表现在大便、小便、吃饭、移动、活动、穿衣、上楼梯等方面的恢复。患者病情近期的改善可能与一些细胞因子营养作用有关，而对于神经功能恢复则需要在干细胞复制、多向分化潜能作用发挥后方可促进组织再生修复。造血干细胞与血管母细胞同源，具有很好的可塑性，能够促使其发挥迁移、归巢、远合的特性，使造血干细胞可以重建病变部位的微循环及对血管内皮细胞的修复，这样的重建及修复需要一定浓度、纯度的造血干细胞作为基础，因此应用分选的CD34+干细胞来实现这样的目标。脐带间充质干细胞具有良好的跨系分化性、趋化性、低免疫源性及免疫调节性，其来源丰富、产率高，对年龄大、病情重、多器官功能减退的患者是很好的选择。

干细胞为CVD后遗症的治疗提供了新的方法，但需要根据患者的具体情况选择不同的干细胞进行治疗，临床上从患者改善的指标看令人鼓舞，且患者未出现明显不良反应。因此，干细胞治疗CVD后遗症是安全可行的，且明显提高了患者生活质量。影像学随访资料仍在进一步观察中。

(本文图片见光盘)

【参考文献】

[1]　李奎成，唐丹，刘晓艳，等.国内Barthel指数和改良Barthel指数应用的回顾性研究.中国康复医学杂志，2009,24(8)：737-740.

[2]　王黎明，周建军，白雯，等.自体分选干细胞治疗15例Duchenne型肌营养不良症的临床观察.中国现代医学杂志，2010,20(1)：66-68.

[3]　吕璐璐，刘拥军，许贞书，等.脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状.福建医科大学学报，2006,40(2)：99-104.

[4]　Zhu L，WuX，Zhang HL.Adultneuralstemcelltherapy Expansion iv itro Tracking in vivoandclinical inicaltransp lantation.J CurrDru Targets,2005,6(1)：97-110.

[5]　陈保忠，张卫华，郑志.神经干细胞移植治疗脑出血后遗症.中国实用医药，2009,4(25)：12-14.

[6]　Rabinovich SS， Seledtsov VI， Banul NV，et al.Cell therapy of brain stroke.Bull Exp Biol Med,2005,139(1)：126-128.

[7]　Bang OY， Lee JS， Lee PH， et al. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients.Ann Neurol,2005,57(6)：874-882.