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《消化病学》

Wnt诱导分泌型蛋白1:研究乙型肝炎诱发肝癌的新途径

发表时间:2014-10-27  浏览次数:1285次

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)为我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位。乙型肝炎病毒(HBV)感染被认为与肝癌的发生密切相关。研究表明,HBV可通过多种路径诱导肝细胞的癌变,包括HBV DNA的整合,HBV基因组的突变以及HBX蛋白的作用等。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)是HBV编码的一种多功能调节因子,可作为一种中等强度的反式作用因子影响多种胞内信号调节通路而引起靶蛋白的表达上调及活化,促进细胞增殖分化并抑制凋亡,最终导致细胞的恶性转化[fs-sl Wnt诱导分泌型蛋白1(Wnt-induced secreted protein-1,WISP-1)是即刻早期基因高半耽氨酸蛋白61/结缔组织生长因子/肾母细胞瘤过度表达基因家族成员之一,具有促进细胞增殖、介导细胞茹附、刺激细胞转移、促进有丝分裂及细胞外基质形成等多种生物学功能f9-iol。本实验以WISP-1在肝癌中的表达情况为切人点,以期初步探讨HBX与W工SP-1之间的调控关系,从新的角度对HBV引起肝癌的机制作出解释。

资料与方法

1.实验材料:组织标本来自2009年至2010的年在华中科技大学附属同济医院肝胆外科手术切除样本;其中肝癌标本50例,其中46例经证实有乙型肝炎且排除重叠感染,2例有丙型肝炎。大部分患者术前未接受完整的放疗和化疗,具有完整的临床病理资料。48例癌旁组织取自距肝癌边缘2 cm以上的肝脏组织,病理证实无肿瘤细胞浸润,无明显细胞增生等病变。正常肝组织10例,取自因其他良性病变(肝血管瘤)而切除部分肝脏组织的患者。HepG2细胞取自华中科技大学同济医院肝病研究所细胞库,pc-DNA3.1(+)和pc-DNA3.1(+)-HBX两种质粒由同济医院肝病研究所谢琼慧博士合成并赠送,经测序鉴定质粒构建成功。OPTI-MEM和脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。B型小量质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。VECTASTA工N ABC免疫组织化学试剂盒购自美国Vector公司。WISP-1抗体购自美国Santa Cruz公司。ReverTra Ace-a逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司。a一肌动蛋白(actin)抗体购自美国Abmart公司。HBX抗体购自中国武汉Boster公司。WISP-1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程技才服务有限公司合成。

2.免疫组织化学:从标本切取部分组织,压4%甲醛固定,石蜡包埋,然后将组织石蜡切片放六60℃烤箱,烘烤30 min。随后按照、rE CTASTAIl}ABC免疫组织化学试剂盒说明书进行免疫组化试验。W工SP-1第一抗体工作浓度为1:50,HBX第一护体工作浓度为1:100,以磷酸盐缓冲液代替第一护体作为阴性对照。结果判读:将染色强度和阳性纸胞数结合起来判断染色结果。先按染色强度评分:与背景颜色相比,无色为0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。再按阳性细胞百分比打分:无阳性细胞为0分;阳性细胞<10%为1分;10%一<30%为2分;30%一<70%为3分;70%一为4分。每张切片随机计数5个高倍视野,每张切片至少评价1000个细胞。每个视野内将以上两项得分相乘,取最后的平均值作为本张切片的最终得分。最终得分>3分为即免疫反应阳性

3.细胞培养及转染:HepG2细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO饱和湿度下培养。提取并扩增pc-DNA3.1(+)和pc-DNA3.1汗)-HBX质粒,使用脂质体Lipofectamine 2000将上述质粒转人接种于六孔板中的HepG2细胞。之后采用6418(500}g/ml)进行筛选培养。约18d以后得到单克隆,改用6418(250,u g/ml)维持培养。传代备份。得到稳定转染含pc-DNA3.1(+)和pc-DNA3.1卜)-HBX质粒的细胞系,命名为Gx细胞和GO细胞,Western blot法鉴定所构建的细胞株,以转染HBV并能稳定复制的HepG2·2·15细胞为阳性对照细胞。4.PCR检测WISP-1 mRNA的表达:以Trizol试剂分别提取Gx和GO细胞中的RNA,荧光分光光度计测定其浓度和纯度。按照ReverTra Ace-a逆转录试剂盒说明将其逆转录成为cDNA。采用引物设计软件Primers.0软件分别设计WISP-1,内参照GAPDH的引物。GAPDH:上游引物5‘-CCCCAGCAAGAGCACAAGAG-3',下游引物5‘-GCACAGGGTACTTTATTGATGGTAC-3‘产物长度177饰;WISP-1:上游引物5‘-AGTGGGTA TGTGAGGA CGA C-3',下游引物5’-GCCTTAAT GAGTGTATGGATGT-3',产物长度251 by。以逆转录的cDNA为模板,按照如下的反应条件进行PCR反应:94 0C 3 min;94℃30 s,55℃30 s,72 0C 1 min,30个循环;72℃5 min。总体系为25时。反应结束后,电泳45 min。之后将凝胶放人紫外凝胶成像分析仪中进行分析。Bandscan5.0软件进行吸光度定量检测。

5.Western blot检测WISP-1蛋白的表达:分别提取Gx和GO细胞中的蛋白质。抽提的总蛋白用BCA法进行定量。将蛋白样品加人十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞氨凝胶中进行电泳,每组60,u g等量上样。电泳结束后取出凝胶并放人转膜槽,将蛋白转入PVDF膜中。用相应抗体对膜进行孵育,最后将膜移人暗室中进行显色反应。Bandscan5.0软件进行吸光度定量检测。

6.统计学方法:所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计处理。两样本率比较采用、2检验。

两均数比较采用t检验,组间比较用F检验。相关分析采用Spearman秩相关系数,检验水准a“0.05。结果1.HBX和WISP-1在肝癌组织中的表达:HBX阳性细胞为胞质着色,呈棕黄色颗粒;WISP-1阳性细胞主要为胞质着色,呈棕黄色颗粒,胞核偶见着色,见图1。肝癌组织中WISP-1的表达阳性率为76.6%,较癌旁组织的23.4%及正常肝组织的0明显增高,xz=35.967,P<0.01,差异有统计学意义,见表l0 44例乙型肝炎相关性肝癌组织中,HBX阳性率为77.27%(34/44),而HBX阳性乙型肝炎相关性肝癌组织中WISP-1的阳性率为85.29%(29/34);HBX阴性乙型肝炎相关性肝癌组织中WISP-1的阳性率为50.00%(5/10),经Spearman相关分析得出肝癌组织中HBX与WISP-1的表达呈正相关行=0.353,P G 0.05)a 2.Gx和GO细胞的构建:Western blot的检测,Gx细胞中发现HBX表达,GO细胞中未见HBX表达,实验结果显示细胞模型构建成功,见图20 

3.HBX促进HepG2细胞中WISP-1 mRNA的表达:PCR分析各组细胞中WISP-1 mRNA相对表达水平,以内参照GAPDH的吸光度值为1500,可知转染HBX后HepG2细胞组中W工SP-1口IRNA的相对表达量为1170.33士41.26,明显高于转染空载体组的265.34士27.47,两组比较,t=31.625,P<0.01,差异有统计学意义,见图30 4.HBX促进HepG2细胞中WISP-1蛋白的表达:western blot检测各组细胞中W工SP-1蛋白的表达,以内参p-actin!的吸光度值为200,分析各组细胞W工SP-1蛋白的相对表达量。转染HBX后HepG2细胞(Gx)中WISP-1蛋白的相对表达量为240.33士11.37,明显高于转染空载体组(GO)的40.33士7.09,略低于作为阳性对照组(H印G2}2}巧细胞)的304.36士10.82,F=600.565,P<0.01,差异均有统计学意义,见图40讨论HBV感染与肝癌密切相关。进一步研究发现,HBX蛋白具有促细胞癌变作用。HBX能够抑制抑癌因子p53的功能,造成突变基因不断累积及遗传稳定性的缺失而致癌。此外,HBX可作为反式作用因子,既能激活包括JAK/STAT和MAP激酶转导通路在内的多种胞内重要的信号通路,亦可广泛激活多种病毒与细胞基因组中的启动子图。深人研究HBX导致肝癌的机制能帮助我们更有针对性地阻断相应的环节,进而更为有效地治疗肝癌。WISP-1基因是由Hashimoto等在对大鼠的黑色素细胞突变体进行RNA筛选时发现的一种新的基因,其编码产生的W工SP-1蛋白为CCN家族成员之一。编码WISP-1的基因定位于人类染色体8q24.1-8q24.3,长度为211加,转录的原始mRNA长度为4.5 kb。成熟的W工SP-1蛋白肤链由367个氨基酸组成,可由成纤维细胞,内皮细胞等多种细胞分泌。研究发现,WISP-1基因在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中呈现高表达状态,并对其转移、增生及分化起着重要作用,有望成为肿瘤诊断和治疗的新的靶点[12-13]。本试验中通过对肝癌,癌旁组织及正常肝组织共计104例标本进行免疫组织化学检测发现,月干癌组织中W工SP-1的蛋白阳性率(76.60%)远高于癌旁组织(23.40%)及正常肝组织(0),且WISP-1与HBX的表达呈正相关份=0.353,P=0.0019)。

表明WISP-1在肝癌中有较高的表达水平,推测W工SP-1对肝癌的形成及发展有一定的影响。为进一步研究WISP-1与HBX之间的关系,我们随后通过对GO和Gx细胞进行PCR及Western blot检测,均发现WISP-1在Gx细胞内的表达显著高于其在GO细胞内的表达。即表明HBX在mRNA及蛋白质水平均可以引起细胞内WISP-1表达的增加。由此推论,HBV感染肝细胞后,其基因组编码的X蛋白可引起细胞内WISP-1表达的上调;过多的WISP-I累积在肝细胞中,使细胞过度增殖、细胞外基质尤其是胶原分泌增多、侵袭性增强并最终引起肝癌的发生。WISP-1是Wnt信号通路下游的靶基因。Wnt蛋白与位于胞膜的受体结合后,通过活化细胞内的Dsh蛋白来对糖原合成激酶3(GSK3)产生抑制,从而使GSK3/APC(结肠腺瘤性息肉基因)复合物对a连环蛋白(a-catenin)的亲和力减弱,减少了a-catenin的降解。不断累积的a-catenir与LEF-1结合,由胞质向胞核转运,在胞核内作为转录因子启动下游基因的转录,W ISP-I便是其中之一。

在此通路中,a-cate二被认为扮演了调节枢纽的关键作用。在WISP-1启动子3的末端有cAMP效应元件结合蛋白(CREB)的结合位点,剔除该位点,则WISP-1对a-catenin的应答降低[L s}。证实该结合位点在阶cat~对W工SP-1的调控中起重要作用。此外,丁浩等[[1〕研究证实HBX可影响L02细胞中民cateni}的细胞定位及转录活性。因此,我们推测HBX引起肝细胞内WISP-1表达上调的原因可能是由于HBX造成了a-caten;n基因的突变,产生了大量突变的a-catenin。突变后的阶cateni}转录活性增强,同时I IBX引起细胞内cAMP的升高并引起PKA(蛋白激酶A)介导的CREB磷酸化,上述因素共同作用于W工SP-1启动子3上CREB的结合位点,使WISP-1基因的转录活性增强,从而引起WISP-I的上调。本实验丰富了乙型肝炎病毒导致肝癌发生的机制。其中WISP-1作为重要中间因子,其在肝癌领域尚有不少问题值得探索:诸如W工SP-1与肝癌的临床病理因素及预后之间的联系;W工SP-1在肝癌的诊断及治疗中的应用价值等。尚有待进一步的试验解决。

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