Neuropilin-1与胃癌发生、发展及血管生成的关系

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,血管生成提供了胃癌生长和转移的潜能。神经纤毛蛋白-1(NRP-1)在神经细胞导向、轴突生长方面发挥调节作用,最近发现可作为血管内皮生长因子(VEGF)的受体,在肿瘤血管新生方面发挥重要作用。本研究通过免疫组化法检测组织中NRP-1、VEGF的表达及微血管密度(MVD),旨在探讨NRP-1与胃癌发生、发展及血管生成的关系和意义。

1材料和方法

1.1材料收集本院外科2008-01-12手术切除并经病理确诊的进展期胃癌标本62例,其中男50例,女12例,年龄44-88岁,中位年龄65岁。同期胃镜活检标本54例,包括正常胃黏膜匆例,胃上皮内瘤变(GIIN)共32例,其中低级别上皮内瘤变(LGN)组织和高级别上皮内瘤变(HGN)组织各16例。胃癌分期按AJCC胃癌TNM分期(2010年第7版)标准。鼠抗人NRP-1单克隆抗体来自英国公司,鼠抗人VEGF、CD34单克隆抗体及ElivisionTM试剂盒均购于基因科技(上海)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫组化检测采用免疫组化ElivisionTM法。标本用甲醛固定,石蜡包埋,4um连续切片。组织抗原修复后加一抗,依次加聚合物增强剂及酶标抗鼠/抗兔聚合物,0.05%DAB显色。以PBS液代替一抗作为阴性对照,以已知阳性片(公司提供)作为阳性对照。

1.2.2阳性结果判断标准NRP-1、VEGF阳性染色信号为棕黄色或棕褐色颗粒,结果判定根据文献报道采用半定量积分法",对每张切片的阳性细胞着色强度及阳性细胞率分别进行分级计分。染色强度:不染色计0分;轻度染色(淡黄色)计1分;中度染色(黄色)计2分;强染色(棕黄色或黄褐色)计3分。阳性细胞率:选染色均匀区,在硐0倍视野下计数着色细胞占视野细胞总数的百分数,共计数5个视野,取平均值。阳性细胞率(0、(乃%、笏%~50%、)sO%)分别计分为0、1、2、3。按上述两项之和判断结果:0分为阴性(),卜2分为弱阳性(+),3~4分为阳性(++),5~6分为强阳性(+++)。

1.2.3MVD计数参照Weidller等回的方法:以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为CD“阳性,微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数。先低倍镜(×40)下观察,确定3个血管着色最密集的区域(热点),然后在高倍镜(x绷0)下计数这3个视野的微血管数,取其平均值为该片的VD值。

1.3统计学处理采用SPSS16.0统计软件。计数资料采用'检验、F蚺"精确概率法。MVD以妊滚示,两组间比较采用成组j检验,多组间比较采用单因素方差分析指标间的关系采用非参数∞earmall等级相关分析。

2结果

2.1病变及正常胃黏膜中NRP-1、VEGF的表达及VD比较胃癌组织中NRP-1、VEGF表达主要位于癌细胞胞膜上和胞质内,呈棕黄色或棕褐色的颗状物质,弥漫分布于整个胞质或沿胞膜周边呈线状分布(图-4,见插页)。NRP-1、VEGF阳性率及MVD在正常胃黏膜组(上皮内瘤变组(胃癌组(均P<0.05)。1丿GN组与HGN组的NRP△、VEGF阳性率比较差异均无统计学意义(均P>0.05),但MVD比较有统计学意义(P(。∞)。HGN组与胃癌组比较:NRP1阳性率及MVD差异均有统计学意义,而VEGF阳性率差异无统计学意义(P)0.ω),见表1。

2.2胃癌组织中NRP1、VEGF的表达及MVD与临床病理特征的关系NRP1、VEGF的表达及MVD:(1)在不同性别、年龄、肿瘤的部位及大小组别之间,差异均无统计学意义(均P)0.Os);(2)在淋巴结转移与否、不同浸润深度、不同TNM分期组别之间,差异均有统计学意义(均P(0.∞):淋巴结转移组高于无转移组;浆膜或浆膜外浸润组高于未达浆膜层组;TNM分期Ⅲ+Ⅳ组高于I+Ⅱ组。(3)NRP-1、VEGF表达阳性率在低、未分化组高于高、中分化组(均P<0.05),而MVD差异无统计学意义(P>0.Os),见表2。

2.3胃癌组织中NRP-1、VEGF的表达与MVD的关系NRP·1、VEGF表达阳性组的MVD高于各自阴性组(均P(0.01),见表3。

2.4胃癌组织中NRP-1、VEGF表达的相关性NRP-1与VEGF共同阳性表达者占缌.387%(30/62),表达强度呈正相关(冖0.286,P<0.05)。

2.5胃癌组织中NRP-1、VEGF的联合表达与MVD的相关性当两者联合共同表达阳性时,其MVD高于任一种阳性表达以及高于两者均表达阴性时(P<0。“),见表4。

3讨论

1987年%kagi等H在非洲蟾蜍神经组织中发现了一种与神经生长导向有关的细胞膜表面I型跨膜糖蛋白,称为A5抗原。由于早期发现A5抗原在神经纤维的特殊区域中表达,19%年F"油wa等四将之命名为Neu_ropilin(NRP)。NRP有两个亚型:NRP-1和NRP乇,它们结构相似,约钾%氨基酸序列同源。NRP-1由位于染色体10p12的11狄b基因编码,其开放阅读框由田个外显子和16个内含子组成囵。最初研究显示NRP为collapsill/⒃maphorin家族受体,在神经细胞导向、轴突生长方面发挥调节作用。近年研究发现,NRP可表达于内皮细胞和肿瘤细胞,作为VEG「1“及与血管新生相关的其它几种VEGF家族成员的受体,在肿瘤血管新生方面发挥重要作用。

在正常成人,NRP-1主要表达于内皮细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞等。而许多肿瘤中,如前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌等,也有NRP-1的表达。Halascl等囵研究发现:在消化道肿瘤发展过程中,随着腺体的发育异常从低到高,癌前病变组织中NRP丬表达强度和范围随之增加,食管、胰腺、结直肠癌中NRP-1的表达水平与癌浸润及转移程度呈正相关,提示NRP-1可能与消化道肿瘤的发生和发展有关。Bαge等冂的肝癌靶基因治疗研究发现:NRP-1在转基因的肝癌小鼠肝脏中,随疾病进展,NRP-l表达增加。Ght,由等囵观察到:NRP-l在乳腺癌早期病变中可能与肿瘤生长及进展有关,并且在乳腺癌浸润和转移中起重要作用。胃癌通常需经历多年的癌前病变过程,胃上皮内瘤变与胃癌关系密切,HGN与绷%~1OO%早期胃癌相关,并见于5%~80%进展期胃癌的癌旁组织阴。本研究发现:随胃黏膜病变的进展,NRP-1表达率逐渐升高,差异有统计学意义,且NRP-1的表达与胃癌的淋巴结转移、浸润程度存在密切相关性,提示NRPt1参与了胃癌的发生和发展过程。肿瘤新生血管的生成提供了肿瘤的失控、侵袭性生长和转移的潜能,恶性肿瘤诱导血管生成的能力在一定程度上决定了肿瘤的发生和发展。MVD反映了肿瘤组织的血管生成状态,目前已广泛应用于肿瘤血管生成的研究。肿瘤血管生成受多种血管生成因子和血管生成抑制物的调控,其中VEGF是中心调控因子。VEGF能直接促进血管生成并可增强血管内皮细胞表达黏附分子,通过纤维蛋白溶解酶系统及金属蛋白酶,降解细胞外基质,促进肿瘤的浸润和转移Ⅱα。

本研究表明:VEGF表达率与胃黏膜病变程度及胃癌的淋巴结转移、浸润程度存在密切相关性,提示VEGF参与了胃癌的发生和发展过程。而且MVD在正常胃黏膜、上皮内瘤变、胃癌组织中呈递增现象,表明在正常胃黏膜向胃癌转变过程中,存在着大量的微血管生成,血管生成在胃癌的发生过程中起一定的作用。伴淋巴结转移、浆膜及浆膜外浸润组的MVD高于无淋巴结转移、无浸润组,提示:肿瘤内新生血管越丰富,越容易发生侵袭及转移。

近年来,有研究发现NRP-1基因过度表达可促进肿瘤血管新生和肿瘤生长、迁移,是正向调节因子。Mia通过诱导前列腺癌细胞过度表达NRP-1,发现肿瘤显著增大、内皮细胞增殖、肿瘤毛细血管密度增加、血管扩张。进一步研究发现,NRP-1是VEGF1b~s的复合受体,其生物学功能主要与VEGF1甾和血管内皮细胞表面受体(VEGFR)-2有关。乩ker等[1]纣培养了单独表达NRP-1、VEGFR-2以及协同表达NRP-1、VEGFR-2的内皮细胞系,发现与单独表达VEGFR乇的内皮细胞相比,协同表达NRP-1、VEGFR-2可力昭虽VEGF165与VEGFR-2的绡合,增强VEGF1g~s介导内皮细胞趋化活性及有丝分裂原性。表明在内皮细胞中NRP-I是作为VEGFR-2的协同受体而发挥作用的。体外培养内皮细胞同时观察到:只有在NRP-1存在的情况下,VEGF刺激所产生的细胞有丝分裂和内皮细胞趋化性才存在卩到。当VEGF1甾与NRP-1结合受时,VEoF165与VEGFR-2结合及其有丝分裂原活性也被抑制,可见NRP-1是通过调节VEGF与VEGFR乇结合及其生物活性而影响VEGF诱导的血管形成的等Ⅱ习研究认为,在同一内皮细胞或肿瘤细胞上NRP-1和VEGFR-2之间形成以VEGF1甾为中心的桥联结构,拉近了彼此间的距离,从而增强了V宝GF的结合能力及功能活性。本研究结果显示:NRP-1阳性表达组的MVD显著高于阴性组,表明NRP·1在胃癌的血管生成中起到促进作用:而且胃癌组织中NRP-1与VEGF共同阳性表达者占缌.3汐%,表达强度呈正相关。且共同阳性表达组的MVD显著高于其它组,表明NRP1和VEGF联合表达时增强了促血管生成的效应,提示NRP-1可以放大VEGF的促血管生成的生物学效应。

综上所述,笔者认为NRP-1基因的过度表达与胃癌的发生、发展有关,可作为评价胃癌生物学行为的指标之一。同时,NRP-1可以增强VEGF的生物学作用,促进胃癌的血管生成,NRP-1作为肿瘤抗血管治疗的靶`点具有一定的价值。本研究通过免疫组化法从形态学的角度在蛋白水平对NRP-1、VEGF与胃癌的关系及相互之间的关系进行了初步探讨,今后还需从基因水平进行深入研究,以更深层次地揭露这些环节和规律。

4参考文献