E Cadherin在进展期胃癌转移淋巴结中的再表达及意义

　　作者：刘津,赵琪,张国建,段国强,薛平,宋子军　　作者单位：050000 石家庄市, 河北医科大学第二医院胃肠外科

　　【摘要】 目的 检测进展期胃癌及其转移淋巴结中上皮型钙粘蛋白(E Cadherin ,E Cad)及其mRNA表达，从而为胃癌的诊断、治疗及预后提供依据及线索。方法 采用免疫组织化学染色的方法观察比较E Cad 在进展期胃癌原发灶及转移淋巴结中的表达; 同时用逆转录 多聚合酶链反应(RT PCR)方法检测上述标本中E Cad 基因的表达，并对其和临床病理参数的关系进行分析。结果 (1)在38例胃癌原发灶中94.7%(36/38) E Cad表达程度减低, 21.1%(8/38)胃癌转移淋巴结中E Cad再表达阳性,其中高分化胃癌的再表达阳性率为35.3%(6/17);中低分化胃癌的再表达阳性率为9.52%(2/21)。高分化癌相对于中低分化癌更易出现E Cad的再表达阳性,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2)RT PCR结果显示，38例原发灶组织及相应转移淋巴结均检测到不同程度的E Cad mRNA表达。E Cad mRNA在胃癌的表达量(0.737±0.010)明显低于胃正常黏膜表达量(0.799±0.018)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01);结合临床病理参数分析，高分化胃癌转移淋巴结中E Cad mRNA表达高于低分化胃癌转移淋巴结，管状腺癌转移淋巴结中E Cad mRNA表达高于粘液腺癌转移淋巴结。结论 E Cad基因变化与肿瘤的发生、浸润、转移有关, E Cad基因治疗可作为胃癌治疗的靶点。

　　【关键词】 胃肿瘤 上皮钙粘蛋白 免疫组织化学染色 逆转录多聚合酶链反应

　　Expression of E Cadherin in human advanced gastric carcinoma and its clinical significance LIU Jin, ZHAO Qi,ZHANG Guojian,et al.The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000

　　【Abstract】 Objective To investigate the expressions of epithelial cadherin (E Cad) protein and mRNA in human advanced gastric carcinoma and metastasis lymph node, and to provide the evidence and clue for diagnosis and treatment of gastric carcinoma. Methods Immunohistochemical staining was used to examine the expression of E Cad in 38 cases of human advanced gastric carcinoma tissues and metastasis lymph node. E Cad mRNA was evaluated in the above mentioned samples by semi quantitative RT PCR, and the correlation between E Cad mRNA expression and its related clinicopathological parameters was analyzed.Results Immunohistochemical staining showed that the abnormal expression rate of E Cad herin was 94.7% (36/38), and the expression rate of E Cad in metastasis lymph node was 21.1% (8/38). The expression rate in well differentiated gastric carcinoma was significantly higher than that in poorly differentiated gastric carcinoma. RT PCR showed that the expressions of E Cad mRNA in 38 cases of human advanced gastric carcinoma and metastasis lymph node were different. E Cad mRNA in advanced gastric carcinoma (0.737±0.010) was significantly lower than that in adjacent normal tissue (0.799±0.018) (P<0.01). The result of RT PCR indicated that the expression of E Cad mRNA in metastasis lymph node was significantly correlated with the tumor differentiation status and tumor type. Conclusion E Cad herin expression is associated with invasion and metastasis of gastric carcinoma, suggesting it is an important factor for judging invasion of gastric carcinoma.

　　【Key words】 gastric cancer; E cadherin; immunohistochemistry; RT PCR

　　胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁我国人民的健康。在我国其发病率呈逐年上升趋势，且居肿瘤患者病死率之首[1]。其死亡原因多为肿瘤的转移和复发,肿瘤转移是一个复杂的、多步骤的连续过程[2]，包括肿瘤细胞黏附于基质 蛋白水解酶降解基质 肿瘤细胞移动过程,其中细胞黏附是一个重要环节。细胞间黏附作用在包括胚胎形成、细胞极性的维持、细胞的生长分化以及癌变过程中担当重要角色[3]。上皮型钙黏蛋白(E Cadherin,E Cad) 是钙黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亚型的一种,集中表达黏着连接。在介导上皮细胞与上皮细胞的黏附、维持组织正常形态结构中发挥重要作用。本研究以进展期胃癌及其转移淋巴结组织作为研究对象，采取免疫组化及RT PCR的方法研究E Cad在转移淋巴结癌细胞中再表达，从而进一步明确E Cad再表达的原因，为胃癌的诊断和治疗提供依据及线索。

　　[1] 材料与方法

　　1.1 材料 所用进展期胃癌及转移淋巴结标本共38例,均为我院2007年2月至2008年4月手术切除标本,并选取其中20例对应的距癌肿边缘5～10 cm 的正常胃黏膜组织作对照，标本在-80 ℃冰箱中冻存。其中，男24例,女14例;年龄27～76岁，平均年龄56.42岁。患者术前均无辅助化疗及内分泌治疗史, 所有标本术后均经病理证实，各例淋巴结转移癌组织的病理学类型与原发灶基本相同。依据胃癌分化程度及生物学行为特征分为3组:(1)分化程度:高分化、中低分化;(2)组织学类型：管状及乳头状腺癌、黏液腺癌。见表1。表1 胃癌临床病理学特性与转移淋巴结中E cad基因表达的关系E Cad单抗及S P试剂盒购自北京中山科技公司; Trizol购自Invitrogen公司;cDNA第一链反应试剂盒购自 Fermentas公司; PCR引物序列由赛百盛生物工程公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学染色：石蜡块4 μm切片,70 ℃烤片15 min,梯度乙醇脱水,3 %H2O2灭活内源酶, PBS漂洗5 min×3次。正常羊血清室温孵育15 min。滴加20～30 μl PBS稀释的一抗(1∶5 的HECD 1单抗)4℃过夜。PBS漂洗5 min×3次。二抗、三抗依次37℃孵育45 min,PBS漂洗5 min×3次。DAB显色5～10 min,自来水充分洗涤,苏木素复染15 min,稀盐酸淡化30 s,冲洗5 min。脱水、透明、封片,镜检。原发灶切片内非癌性胃黏膜细胞作为内部阳性对照。E Cad主要定位于细胞膜，即连续的细胞膜染色。通过苏木素 伊红(HE) 染色确认原发灶和转移淋巴结内癌细胞,如癌细胞染色情况与临近非癌性黏膜细胞相近,且没有胞浆染色情况出现,则被评定为正常染色;如染色不连续,明显减弱或缺失,或出现胞浆染色情况,则被评定为不正常染色。每张切片按其全部癌细胞中出现正常染色细胞的百分率评定为三级:1级为0～50%,2 级为51%～80%,3 级为81%～100%[4]。原发灶中如某一种黏着分子为三级染色则被认为正常表达;1级和2级染色被认为不正常表达;转移淋巴结中如某种黏着分子染色等级高于其原发灶中,则被评定为再表达阳性(图1) 。

　　图1 E Cad在同一胃癌患者原发灶(A)和转移淋巴结(B)的表达

　　1.2.2 逆转录 多聚合酶链反应(RT PCR)将组织标本研磨后，采用Trizol细胞裂解法按照说明书提取组织样本总RNA。紫外分光光度计定量总RNA，调整浓度为1 g/L。按DNA第一链反应试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA。用β actin作为内参照进行PCR。E Cad引物序列：上游：5' GTACTTGTAATGACACATCTC 3'，下游5' TGCCAGTTTCTGCATCTTGC 3'，扩增长度252bp;β actin的引物序列：上游：5' GTTTGAGACCTTCAACACCCC 3'，下游5' GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC 3'，扩增长度300 bp;参数：95℃变性5 min;55℃ 100 s;72℃ 105 s，进行35个循环，最后72℃维持10 min。PCR产物于20 g/L琼脂糖电泳，电压60 V，55 min。GelID凝胶图像分析系统摄片并测定分析其光密度。分别计算各个样本E Cad基因表达量的相对值(relative expression value)=待测基因扩增条带的灰度值/β actin基因扩增条带的灰度值。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　[2] 结果

　　2.1 免疫组化结果及其与临床病理因素的关系 在38例胃癌原发灶中36例患者E Cad表达降低，胃癌中17例为高分化癌，21例为中低分化腺癌，其中22例为管状腺癌及乳头状腺癌，16例为黏液腺癌。17例高分化癌中1级染色10例，2级染色4例，3级染色1例，正常染色2例，21例中低分化癌中1级染色17例，2级染色4例。22例管状及乳头状腺癌中1级染色14例，2级染色6例，正常染色2例，16例黏液腺癌染色均为1级。E Cad的再表达阳性率为21.1%(8/38) (图1)，其中高分化胃癌的再表达阳性率为35.3%(6/17)，中低分化胃癌的再表达阳性率为9.52%(2/21)，高分化癌相对于中低分化癌更易出现E cad的再表达阳性。管状及乳头状腺癌再表达阳性率为22.72%(5/22)，黏液腺癌的再表达阳性率为18.75%(3/16)。两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 RT PCR结果及其与临床病理因素的关系 E Cad和β actin引物的扩增基因片段经电泳和EB染色后可见清晰电泳条带，其扩增片段大小与所设计的大小完全一致，分别为252 bp、300 bp。E Cad表达量相对值在胃癌原发灶和正常胃黏膜中分别是(0.737±0.010)和(0.799±0.018)，两者比较差异有统计学意义(t=14.246，P<0.01)，见图2。E Cad在原发灶及转移灶中的表达量分别为(0.737±0.010)和(0.745±0.009)，两者比较差异有统计学意义(t=3.436,P<0.01)。E Cad表达量相对值在中低分化及高分化转移淋巴结中分别是(0.741±0.008)和(0.750±0.011)，两者比较差异有统计学意义(t=3.034,P<0.01)。E Cad表达量相对值在管状及乳头状腺癌转移淋巴结中是(0.748±0.010)，在黏液腺癌转移淋巴结中是(0.741±0.008)，两者比较差异有统计学意义(t=2.549,P<0.05)。见表1。

　　2.3 在2例正常染色的胃癌原发灶中E Cad mRNA表达量较正常胃黏膜降低,其转移淋巴结癌组织中E Cad mRNA表达量较原发灶中增高,但仍低于正常胃黏膜。同时,再表达阳性的转移淋巴结中E Cad mRNA表达量为0.749±0.013,再表达阴性的转移淋巴结中E Cad mRNA表达量为0.741±0.008,两者比较差异有统计学意义(t=2.567,P<0.05)。

　　[3] 讨论

　　E Cad是Ⅰ型跨膜糖蛋白,其分子结构主要包括胞内段、跨膜段和细胞外段。几乎所有的钙黏蛋白胞内段均包含1个高度保守的结构域,该段通过α,β,γ连环蛋白与细胞骨架结合。相邻细胞E Cad的胞外域可相互结合形成拉链样结构,使细胞黏附[5]。近年的研究表明，E Cad的突变和表达量的变化与肿瘤的发生和转移密切相关。E Cad的减少、异质性和非极性分布使细胞间的黏附减弱,癌细胞易于脱落,这是癌转移的首要环节[6]。E Cad的黏附功能丧失是细胞获得去分化和高浸润性的关键。将E Cad的cDNA转染到高浸润性、低分化的上皮肿瘤细胞,可导致其体外浸润性能力下降[7]。高转移和低表达E Cad的细胞在转染E Cad cDNA后,成瘤性和转移性均受到抑制。体外实验表明,人胃癌细胞株在E Cad失去表达后,癌细胞分化差、且表现出纤维细胞形态。E Cad介导的黏附系统已被公认为“浸润抑制系统”[8]。

　　Bukholm等[9]研究发现在乳腺癌患者的转移淋巴结存在E Cad的再表达。我们的免疫组化实验结果也证明，胃癌组织中E Cad中表达降低，但在转移淋巴结组织中却出现较高的再表达阳性率，充分说明E Cad在转移灶内的再表达阳性与癌细胞在转移部位的再聚集和生长有关, 推断原发灶的形成是由于E Cad功能缺失导致,而且转移形成所需要的黏附特性可能通过E Cad再表达而再次获得[10，11],这种现象可能是蛋白表达的动态调节过程。同时研究还表明分化程度越低其异常表达的阳性率越高，说明癌的分化程度依赖于E Cad的维持[12]。RT PCR结果表明在进展期胃癌原发灶及转移淋巴结中均有不同程度的E Cad mRNA表达，且均低于正常对照胃黏膜组织，因此可以认为是由于各种因素如突变、甲基化导致E Cad在基因水平发生变化，从而造成胃癌的转移与浸润。E Cad mRNA在原发灶中的表达量低于在转移淋巴结中的表达量，可能说明癌细胞自原发灶脱落及在转移灶的再聚集是基因水平的独立系统调控,其始动基因有待于进一步确认。同时我们的试验表明在2例正常染色的胃癌原发灶中E Cad mRNA表达量降低,说明E Cad mRNA表达降低是胃癌发生的早期事件。再表达阳性转移淋巴结中的E Cad mRNA表达量高于再表达阴性的转移淋巴结,表明上皮型钙黏素蛋白下调的原因主要是因为其mRNA转录水平降低所造成的。

　　通过转移淋巴结中E Cad mRNA表达量与临床病理因素的分析,表明原发肿瘤的分化程度及组织学类型与转移淋巴结中E Cad mRNA的表达密切相关,因此检测转移淋巴结中的E Cad的表达可作为判断预后的重要标志。

　　因此,作为临床评价胃癌的一项新的生物学指标,E Cad的检测有助于胃癌的诊断,同时也为胃癌的治疗提供基因治疗的靶点，对于临床治疗及判断预后亦具有重要的参考意义。

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