血管内皮生长因子165基因对人胃癌细胞侵袭性的影响

　　作者：乐红琴,欧希龙,杭程,陈慧娟　　作者单位：.东南大学医学院附属盐城医院 消化内科，江苏 盐城 224001;2.东南大学附属中大医院 消化内科，江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的：探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)基因对胃癌细胞侵袭性的影响及可能机制。方法：通过体外培养人胃腺癌细胞BGC823，观察胃癌细胞转染VEGF165基因对其迁移能力及侵袭相关分子MMP2、uPA mRNA表达的影响。应用Millicell小室分析VEGF165转染前后胃癌细胞迁移能力的变化;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)研究VEGF165转染前后BGC823的MMP2、uPA mRNA表达变化。结果：迁移实验结果显示AdVEGF165组胃癌细胞迁移能力高于AdGFP组及对照组[(212.000 0±10.148 8) vs (142.666 7±14.502 8) and (148.333 3±7.571 8),P<0.05];RTPCR结果显示VEGF165转染后促进了BGC823的MMP2、uPA mRNA表达，AdVEGF165组MMP2、uPA的mRNA水平明显高于AdGFP组及对照组[MMP2 mRNA：(0.664 6±0.048 6)vs (0.409 6±0.066 8) and (0.380 3±0.025 4);uPA mRNA：(0.821 6±0.079 8) vs (0.406 0±0.115 8) and (0.404 3±0.062 0);均为P<0.05]。结论：经VEGF165转染后，胃癌细胞迁移能力增强，MMP2、uPA的mRNA表达增加，提示VEGF在肿瘤的侵袭过程中发挥促进作用，MMP2、uPA可能与此作用有关。

　　【关键词】 血管内皮生长因子165; 胃癌; 侵袭; 迁移实验;基质金属蛋白酶2; 尿激酶型纤溶酶原激活物

　　胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，淋巴结转移、血行转移和腹膜种植转移是其最常见的转移方式,预后较差。阐明胃癌细胞侵袭转移的机制,可以为胃癌侵袭转移的早期诊断和靶向治疗提供理论基础。近年来人们已经在人和动物的胃癌组织中发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的过度表达,且其过度表达与肿瘤的侵袭、转移密切相关。为进一步了解VEGF能否通过自分泌途径增强胃癌细胞BGC823的侵袭力及其机制，故设计本实验。本实验通过体外培养人胃癌细胞BGC823，观察BGC823转染VEGF165对其迁移能力及对侵袭相关分子基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases2，MMP2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator，uPA)分泌的影响，旨在进一步探讨VEGF在胃癌侵袭转移中的作用及可能机制，对胃癌转移和复发的早期诊断及靶向治疗有重要意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人胃腺癌细胞株BGC823购自中国科学院，复制缺陷型腺病毒(Ad)重组体AdVEGF165及对照病毒Ad绿色荧光蛋白(GFP)由南京医科大学第一附属医院构建并赠送，RPMI 1640低糖培养基购自美国Gibco brl公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。Trizol试剂及RTPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，PCR引物由上海英俊生物技术有限公司设计并合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 BGC823用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化后进行传代，一般1～2 d传1代，1瓶接种2至3瓶，隔日更换培养液继续培养。

　　1.2.2 病毒转染 实验分成对照组、AdGFP组和AdVEGF165组等3组，以细胞浓度为2.0×105 ml-1分别取3 ml接种于3个培养瓶(50 ml)中，于60%～70%细胞贴壁时吸出原培养液，对照组加入无血清无抗生素RPMI 1640培养液3 ml，后两组加入相应的无血清无抗生素RPMI 1640培养液稀释的病毒液3 ml转染[在前期试验中已经测得Ad的感染复数(MOI)值在20的时候达到最佳的感染效果，本实验MOI值与前期实验相同]。8 h后换含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养36 h，对转染前后的细胞行部分生物学特性研究。

　　1.2.3 Millicell小室细胞体外迁移实验 分别收集对照组、AdGFP组和AdVEGF165组细胞，用0.25%胰酶消化后,使用无胎牛血清的RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，制成单细胞悬液，细胞浓度为1×105 ml-1。将Millicell小室放入6孔板中，下室中加入1 600 μl含10%胎牛血清的培养液,上室加入无胎牛血清RPMI 1640培养液稀释的单细胞悬液100 μl,每组细胞设3个复孔,置于37 ℃、5%CO2 的细胞培养箱中培养8 h，取出滤膜,用95%酒精固定细胞，然后行HE染色，轻轻用棉签擦净小室上室面无侵袭性的细胞，显微镜下每张滤膜随机取5个视野,计数穿膜细胞数,取平均数表示每组肿瘤细胞的迁移能力。

　　1.2.4 RTPCR检测VEGF165转染前后BGC823的MMP2、uPA mRNA表达变化 分组仍为对照组、AdGFP组和AdVEGF165组，按前述方法培养及感染细胞后进行逆转录。按Trizol一步法提取细胞总RNA，无RNase水配制的电泳缓冲液及琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性。RNA电泳可见3条带，分别为28、18、5 S亚基，28 S与18 S荧光强度之比为2∶1，说明RNA完整。按RTPCR试剂盒说明行逆转录反应获得细胞总cDNA，取3 μl cDNA行目的片断DNA扩增。PCR 引物序列及扩增片段长度见表1。MMP2的反应条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，50.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环后再于72 ℃ 延伸10 min。uPA的反应条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环后再于72 ℃ 延伸10 min。因所选PCR扩增基因时选用的片段长度为230、324 bp，故选用的内参照是扩增产物片段长度为641 bp的β肌动蛋白(βactin)。βactin反应条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环后再于72 ℃ 延伸10 min。PCR产物立即进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色，剩余产物-4 ℃冰箱保存。电泳时用的是600 bp的Marker。PCR产物进行电泳后，紫外检测仪下观察DNA扩增情况，用ImageMaster VDS扫描分析仪扫描凝胶图谱，采用LabImage图像分析系统(LabImage Version 2.7.1)进行半定量分析，测量区带密度，计算样品的目的区带与内参区带的密度比。实验重复3次。

　　1.3 统计学处理

　　实验结果中计量资料以均数±标准差表示，均数间比较采用t检验。所有数据均采用Stata 9.1统计软件进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。 表1 PCR 引物序列及扩增片段长度

　　2 结 果

　　2.1 迁移实验实验结果

　　每个小室随机抽取5个视野,计算每个视野的细胞总数。结果发现,AdVEGF165组胃癌细胞穿过微孔膜的细胞数明显高于AdGFP组及对照组(P<0.05)，这提示在VEGF165转染后胃癌细胞的体外迁移能力增强,结果见表2、图1。表2 各组穿过滤膜细胞数1)与对照组比较，P >0.05;2)与AdGFP组和对照组比较，P<0.05

　　2.2 RTPCR检测BGC823的MMP2、uPA mRNA表达 MMP2、uPA在3组细胞中均有表达。MMP2 mRNA在3组的表达分别为:对照组(0.380 3±0.025 4)、AdGFP组(0.409 6 ±0.066 8)、AdVEGF165组(0.664 6±0.048 6)(图2)。AdVEGF165组的MMP2 mRNA的表达水平明显高于对照组和AdGFP组,差异有统计学意义(P<0.05),而后两组间比较差异无统计学意义。提示AdVEGF165转染体外培养的BGC823后促进了该细胞MMP2 mRNA的表达，而GFP对 BGC823的MMP2 mRNA的表达没有影响。uPA mRNA在3组的表达分别为:对照组(0.404 3±0.062 0)、AdGFP组(0.406 0±0.115 8)、AdVEGF165组(0.821 6±0.079 8)(图3)。AdVEGF165组uPA mRNA的表达水平明显高于对照组和AdGFP组,差异有统计学意义(P<0.05),而后两组间比较差异无统计学意义。提示VEGF165转染体外培养的BGC823上调了该细胞uPA mRNA的表达，而GFP对BGC823的uPA mRNA的表达没有明显影响。1.对照组;2.AdGFP组;3.AdVEGF165组

　　3 讨 论

　　VEGF是一种多功能的细胞因子，在血管形成及肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。肿瘤细胞可以合成、分泌VEGF，在多种肿瘤细胞上都有VEGF受体的表达[1]。VEGF家族中包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盘生长因子六大成员，通常所说的VEGF即是指VEGFA。有研究表明,胃癌患者血浆VEGF的水平显著高于正常人。胃癌患者血浆VEGF水平与胃癌分化程度、有无区域淋巴结转移和有无远处转移有关。胃癌分化程度较差、有区域淋巴结转移和有远处转移的患者,血浆VEGF水平有显著性增高[2]。Kondo等[3]研究了胃癌部分切除术后病人80例，用免疫组织化学方法测VEGFC和VEGFA蛋白表达，VEGFC和VEGFA阳性表达率分别为75例(93.8%)和41例(51.3%)，VEGFA表达与肿瘤分化(P=0.001 7)、血管侵犯(P=0.000 4)明显相关，VEGFC阳性表达只与肿瘤分化有关系(P=0.016 8)，然而VEGFC和VEGFA同时表达者淋巴结转移率明显增加(P=0.036)。而且，两者同时表达与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴管和血管侵犯明显相关。Zhang等[1]报道在RF1、RF48、AGS1、NCIN87、NCISNU1、NCISNU5、NCISNU16和KATOⅢ等8个表达有VEGF121和VEGF165的胃癌细胞株中，有6个同时表达FLT1和KDR;而细胞株NCISNU5仅表达FLT1，KATOⅢ既不表达Flt1也不表达KDR，免疫组化显示胃癌组织中Flt1和KDR阳性表达率高达84.6 %(44/52)及70 %，且外源性的VEGF以剂量依赖的方式刺激KDR阳性细胞株NCIN87和AGS1生长,但对KDR阴性的KATOⅢ细胞株则没有作用。该研究提示，VEGF可能通过旁分泌和自分泌途径促进胃癌细胞的生长。

　　为此，我们利用Ad作为载体将VEGF165基因导入BGC823，检测VEGF165对其侵袭能力的影响，在前期实验中我们已将腺病毒重组体AdVEGF165进行扩增、纯化后转染胃癌细胞株BGC823，证实AdVEGF165成功导入BGC823后促进了该细胞的VEGF及VEGFR2的表达，并证实其对胃癌细胞的促增殖作用[4]。本实验利用前期制备的高滴度AdGFP和AdVEGF165cDNA，并按MOI=20最佳转导率对胃癌细胞进行转染。迁移实验结果显示，AdVEGF165组细胞的体外迁移能力明显高于AdGFP组及对照组，而AdGFP组及对照组之间比较无明显差异，说明VEGF165能够促进体外培养的BGC823的迁移。

　　为再次确认VEGF基因转染增加胃癌细胞的侵袭性及其机制，我们应用RTPCR检测了转染VEGF165基因前后侵袭相关分子MMP2和uPA的mRNA表达水平。肿瘤细胞浸润扩散过程中细胞基膜是一道天然屏障,肿瘤细胞必须要穿过细胞外基质和基膜屏障才能进一步侵入脉管、侵犯神经或肌肉。在肿瘤细胞侵袭、转移的过程中，降解和破坏细胞外基质是关键步骤，基质金属蛋白酶在这一过程中起重要作用。MMP2是基质金属蛋白酶家族中重要成员,是参与细胞外基质的主要成分Ⅳ型胶原降解的关键酶，对细胞外多种基质均有降解作用，在肿瘤细胞的浸润和转移的分子机制中扮演着极其重要角色。uPA系统不仅能直接降解细胞外基质中大多数糖蛋白及蛋白多糖的蛋白核心部分，还能激活另一重要的基质降解系统基质金属蛋白酶系统，加强胶原、弹性蛋白等的降解，并与纤溶酶一起促使细胞外基质和血管基质降解，促进肿瘤侵袭和转移[5]。我们的实验结果显示，在3组BGC823细胞株上均检测到了MMP2、uPA的阳性表达，且AdVEGF165组阳性表达率高于对照组和AdGFP组，说明VEGF基因水平的增加可上调MMP2、uPA的mRNA表达。这些结果进一步证实，VEGF基因对肿瘤生长和转移的促进作用除了通过血管机制以外,也有对肿瘤细胞的直接作用。可以认为VEGF在胃癌的侵袭性和恶性潜能方面的作用机制，部分是由于促进MMP2和uPA的生成，进而促进肿瘤细胞外基质和血管基质降解而实现的。

　　VEGF与MMP2、uPA三者之间的相互作用关系尚未明确。我们的实验提示，VEGF基因水平的增加可上调MMP2、uPA的mRNA表达。Shin等[6]在研究尼古丁对胃癌血管生成及肿瘤侵袭的实验中发现：侵袭和转移过程中重要的细胞因子MMP2、MMP9活性及纤溶酶原激活物PA(uPA及其受体)的蛋白表达可被VEGF受体抑制剂降低。Sounni等[7]研究认为，MMP2与VEGF在肿瘤发生、发展中可能存在协同作用。Belotti等[8]认为，在卵巢癌中MMP9和MMP2诱导VEGF释放。进一步阐明VEGF与MMP2、uPA三者间作用关系，对深入探讨VEGF在胃癌侵袭中的意义及作用机制，早期诊断胃癌转移、复发及其靶向治疗有重要意义。

　　【参考文献】

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