胃癌组织中增殖诱导配体及受体mRNAs表达的病理意义
发表时间：2012-03-08 浏览次数：448次
作者：张健锋,毛振彪 作者单位：1南通大学附属医院消化内科， 2病理科， 南通
【摘要】 目的：研究增殖诱导配体(APRIL)及其受体B细胞成熟抗原(BCMA)和穿膜蛋白活化物(TACI)mRNA在胃癌组织中的表达，探讨其临床病理意义。方法：收集30例胃癌及相应癌旁正常胃组织，应用RT-PCR检测APRIL及其受体mRNA在胃癌及癌旁胃组织中的表达。结果：胃癌组织APRIL mRNA阳性率(26/30，86.7%)明显高于癌旁胃正常组织(12/30，40.0%)(P<0.01)，在肠型胃癌中的表达高于弥漫型(P<0.05)，与年龄、性别、病灶大小、临床病理分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移等因素无关。而APRIL受体mRNA在胃癌和癌旁胃组织中表达无差异，且与年龄、性别、病灶大小、临床病理分型和分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移等因素无关。结论：APRIL mRNA异常表达与肠型胃癌的发生有关，检测其表达水平有助于胃癌的早期诊断。
【关键词】 胃癌,增殖诱导配体,B细胞成熟抗原,穿膜蛋白活化物
[Abstract] Objective: To investigate the expression and clinical significance of a proliferation-inducing ligand (APRIL) and its receptors B cell maturation antigen(BCMA)， transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor protein(TACI) mRNA in gastric cancer patients. Methods: Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to examine APRIL and its receptors mRNA in 30 primary gastric carcinomous tissue and the adjacent normal tissue. The expression of APRIL and its receptors mRNAs in patients with various pathological characteristucs were analyzed. Results: Positive APRIL expression was observed in 86.7% of the gastric cancer cases， while 40% in adjacent normal tissues. Significant differences in the expression of APRIL mRNA was found in adjacent normal tissues and the gastric cancer cases(P<0.01)， also showed a statistically significant difference between intestinal-type and diffuse-type gastric carcinoma(P<0.05)， while no significant differences in the expression of BCMA and TACI(P>0.05)， and no significant differences in the expression of the tumor size， differentiated subtypes， infiltrate depth， lymphatic metastases and TNM clinical stage(P>0.05). Conclusion: Over-expression of APRIL mRNA in human gastric tissues may play an important role in the carcinogenesis of the intestinal-type gastric carcinoma， detection of APRIL mRNA will be beneficial to diagnosis human gastric cancer.
[Key words] Gtastric carcinoma; Proliferation-inducing ligand; B-cell maturation antigen; Transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor protein
胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，我国恶性肿瘤中胃癌发病率位居第3位[1]。寻找经济、实用、有效的肿瘤分子标志及早识别胃黏膜癌变是目前的研究热点。本研究应用RT-PCR检测胃癌组织中增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand，APRIL)及其受体B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)和穿膜蛋白活化物(Transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor，TACI)mRNA的表达情况，并与癌旁正常胃组织作比较，分析其与胃癌生物学行为的关系，寻找胃癌早期诊断新的肿瘤标志物。
1 材料与方法
1.1 病例资料 30例胃癌和癌旁胃组织标本均为我院2005年5月~2006年10月手术切除的胃癌组织，标本均在手术切除后20 min内置入液氮罐，转入-70 ℃冰箱保存;所有标本切片皆由2名病理医师双盲法核片分类确定病理类型。胃癌患者中男19例，年龄32~80岁，平均65±11.27岁;女11例，年龄37~81岁，平均65±12.46岁。高、中分化12例，低分化18例;肿瘤<5 cm 14例，≥5 cm 16例;未浸润浆膜层11例，浸润浆膜外19例;无淋巴转移8例，有淋巴转移22例。TNM临床病理分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期15例，Ⅳ期2例。癌旁胃组织均取自胃癌行胃切除的近侧断端胃黏膜，所有断端均距癌组织5 cm以上，组织学检查为基本正常胃黏膜。入选病例均未行化、放疗，无长期服用非甾体类抗炎药、皮质激素药物史。
1.2 实验方法
1.2.1 RNA提取 取组织50~100 mg置入1.5 ml Eppendorf管中，加入1 ml TRIZOL，剪碎，室温放置5 min。加入0.2 ml氯仿，振荡15 s，静置2 min。4 ℃离心，12000 g×15 min，取上清。加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，静置10 min。4 ℃离心，12000 g×10 min，弃上清。加入1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 ℃离心，7500 g×5 min，弃上清。晾干，加入20 μl的DEPC水溶解(65 ℃促溶10~15 min)，于-20 ℃保存。
1.2.2 逆转录反应合成cDNA 取总RNA 1 μg在PCR仪中进行逆转录反应：总RNA1 μg、oligo(dt)primer1 μg、DEPCH2O补齐至12 μl，70 ℃孵育5 min，置冰上;加5×Reaction Buffere 4 μl、RibolockTM Ribonnclease inhibitor 1 μl、10 mM dNTP mix 2 μl，37 ℃孵育5 min，置冰上;加 Revert Aid TM M-Mulv Reverse Transcriptse 1 μl，42 ℃60 min;70 ℃10 min。逆转录成cDNA后分装置-20 ℃保存。
1.2.3 RT-PCR反应 利用Premier 5.0软件，设计如下引物并由上海英骏生物工程公司合成。APRIL上游引物：5'-TCCGATGTGACAGAGGTGATG-3'，APRIL下游引物：5'-AATGGAAGACACCTGCGCTAT-3'，预计扩增片段长度265 bp;TACI上游引物：5'-GCTGAAGCTGAGTGCAGATCA-3'，TACI下游引物：5'-CCCTCTTCTTGAGGAAGCAGG-3'，预计扩增片段长度113 bp;BCMA上游引物：5'-GCATCAAGAGCAAACCGAAGG-3'，BCMA下游引物：5'-TCTATCTCCGTAGCACTCAAAGC-3'，预计扩增片段长度142 bp。GAPDH上游引物：5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'，GAPDH下游引物：5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3'，预计扩增片段长度240 bp。APRIL反应条件：95 ℃预变性30 s，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，31次循环，然后72 ℃ 7 min，最后至4℃终止;BCMA反应条件：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35次循环，然后72 ℃ 7 min，最后至4 ℃终止;TACI的反应条件：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，34次循环，然后72 ℃ 7 min，最后至4 ℃终止;GAPDH反应条件：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45s，30次循环，然后72 ℃ 7 min，最后至4 ℃终止保存。琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1.3 统计学方法 应用Stata10.0软件进行统计分析。率的比较采用χ2检验或者Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 APRIL及其受体mRNA在胃癌和癌旁正常组织内的表达 见图1。经核酸蛋白紫外分析仪检测各标本RNA的A260/280在1.80~1.97之间，提示总RNA质量较好。阳性表达者APRIL位于265 bp，BCMA位于142 bp，TACI位于113 bp，GAPDH位于240 bp。
2.2 APRIL及其受体mRNA在胃癌组织与癌旁胃组织比较 RT-PCR检测APRIL及其受体mRNA在胃癌组织中的表达情况见表1。
3 讨 论
人APRIL编码基因定位于染色体17p13.1上，mRNA约2.1 kb，其在正常组织中表达很弱，仅见于外周血淋巴细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、结肠、脾、胰腺、前列腺等组织;而在结肠癌细胞株SW480和食管癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌和肝癌组织等消化系肿瘤中均有不同程度表达[2-3]。我们以往研究发现胃癌细胞株AGS、SGC27901高表达APRIL mRNA[4]。BCMA和TACI是APRIL的两个受体，后者通过膜结合型和可溶型两种形式与其受体结合促进肿瘤细胞增殖或者抑制细胞凋亡作用[5]。
APRIL在体内外具有促进多种肿瘤细胞增殖和存活的效应。Hahne等[2]报道低浓度重组APRIL能刺激体外培养的多种人类肿瘤细胞株的增殖，且将APRIL转染的NIH-3T3细胞及非转染细胞接种到裸鼠体内后，前者较后者的成瘤速度明显加快。Roth等[6]在APRIL基因转移实验中发现，APRIL能防止瘤细胞免受死亡配体CD95L、FasL和凋亡诱导配体TRAIL/Apro2L诱导的细胞凋亡。Planelles等[7]报道9~12月龄的APRIL转基因小鼠发生腹膜B-1B淋巴瘤;老龄APRIL转基因小鼠发生肠系膜淋巴结和潘氏淋巴结进行性增生，淋巴组织破坏，黏膜和浆膜侵润，最终肿瘤细胞浸润非淋巴组织如肾脏和肝脏导致小鼠死亡。最近还发现[8-9]，APRIL蛋白能与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans， HSPG)特异性结合后，再通过与多种生长因子结合或者使APRIL其它受体之间存在协同作用从而使细胞增殖。胃腺癌组织中表达APRIL，并可能是与HSPG结合的方式存在的[10]。
我们曾报道[11]在肠上皮化生、异型增生和胃癌组织中APRIL基因表达水平显著高于正常胃黏膜、浅表性胃炎和萎缩性胃炎，且APRIL基因在胃癌组织中表达水平显著高于肠上皮化生和异型增生。本实验进一步发现，胃癌组织中APRIL mRNA表达水平明显高于癌旁胃组织，而且在胃癌中的表达与组织学类型有关，在肠型胃癌中表达水平高于弥漫型胃癌，但与年龄、性别、病灶大小、临床病理分期、分化程度、淋巴结转移等因素无关。因此，APRIL基因的异常表达与胃癌的发生尤其是肠型胃癌有关。本研究还提示，APRIL受体BCMA和TACI mRNA在胃癌和癌旁胃组织中的表达水平之间均无统计学差异，以及两者与临床特征和病理类型均无相关性，说明可能还存在肿瘤特异性的APRIL未知受体，有待探讨。
由此可见，APRIL mRNA的异常表达是胃黏膜癌变过程中的“早期事件”，可能参与了从肠上皮化生至肠型胃癌多阶段多步骤的发展过程并起到重要作用，检测其变化可能有助于早期胃癌尤其是肠型胃癌诊断。
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