STAT3SURVIVIN途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡

　　作者：席大勇,卢启明　　作者单位：兰州大学临床医学院临床一部消化内科，甘肃 兰州 730000

　　【摘要】目的: 观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡中的作用. 方法: 不同浓度的槲皮素及阳性对照组(AG490 40 μmol/L)作用细胞后,MTT法检测细胞毒作用;流式细胞术检测细胞凋亡;Real time RTPCR, Western Blotting检测stat3，survivin基因mRNA及蛋白的表达. 结果: 随作用时间延长和浓度增高，槲皮素对SGC7901细胞增殖的抑制作用增强. 48 h槲皮素40 μmol/L组与阳性对照组凋亡率相近. Stat3，survivin mRNA之间呈直线相关关系(r=0.697，P=0.002)，且pstat3和survivin蛋白也呈直线相关关系(r=0.748，P=0.003). 结论: 槲皮素可能通过调控STAT3SURVIVIN途径抑制胃癌SGC7901细胞增殖并诱导凋亡.

　　【关键词】 stat3基因,survivin基因,槲皮素,胃肿瘤,细胞增殖 细胞凋亡 信号转导通路

　　0引言

　　槲皮素(quercetin, Que, 3, 3′, 4′, 5′, 72五羟基黄酮)又称槲皮酮,为中药槲树皮的主要提取成分,具有广泛的药理活性，如抗炎、抗肿瘤等. Stat3，survivin是继bcl2之后相继发现的两个重要的凋亡抑制基因. 大量体内外研究表明抑制这两种基因的表达或功能可以抑制肿瘤细胞生长,促进凋亡[1-2]. 黄酮类抗肿瘤药槲皮素是否通过抑制STAT3SURVIVIN途径促使肿瘤细胞调亡，目前尚属未知. 我们施用槲皮素于胃癌SGC7901细胞,观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料人中分化胃癌细胞株SGC7901,由兰州大学分子生物学教研室提供;干粉型RPMI1640,槲皮素,DMSO,AG490购自Sigma公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;MTT购自Inventrogen公司;总RNA柱式提取试剂盒购自BBI公司;Real Time PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司. Stat3上游引物: 5′CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG3′,下游引物: 5′GCACGTACTCCATCGCTGACA3′,扩增产物114 bp;survivin上游引物:5′AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG3′,下游引物: 5′TCATCCTCACTGCGGCTGTC3′,扩增产物127 bp;内参照GAPDH上游引物:5′GTGCTTTGACAAATCCCATCTGA3′,下游引物:5′GTTACTGT CCCGGATCTTGTCCA3′,扩增产物138 bp,均由宝生物工程(大连)有限公司合成. 兔抗人stat3多克隆抗体购自Cell Signal公司;兔抗人survivin多克隆抗体购自Santa Cruz公司.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养及MTT法检测细胞毒作用SGC7901细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中培养, 37℃,50 mL/L CO2孵箱中贴壁生长, 2.5 g/L胰酶消化传代. 实验分为空白对照组,阴性对照组(0.5 mL/L DMSO)，阳性对照组(AG490 40 μmol/L)，槲皮素4个浓度组(20,40，80，160 μmol/L). 取同一批次对数生长期细胞制成单细胞悬液,5×103/孔接种于96孔板,每组设4个复孔. 24 h细胞贴壁后,弃培养液,加200 μL/孔无血清培养基同步化24 h,再次吸弃培养液,加无血清培养基180 μL/孔及各组药物,使终体积为200 μL/孔,终浓度为所需值. 分别于加药后24,48,72 h测吸光度值A(λ=490 nm). 抑制率计算公式：细胞抑制率(%) =(1-A处理组/A对照组)×100%. 计算IC50值,选择3个浓度进行后续实验.

　　1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素(40 μmol/L)组. 细胞以5×105/mL的浓度接种于50 mL培养瓶，每组3瓶. 处理步骤同上. 加药后48 h胰酶消化，收集细胞,离心(800 r/min，5 min),弃上清,加PBS液至总体积为1.5 mL/管,上流式细胞仪(双染法)检测细胞凋亡.

　　1.2.3Real Time RTPCR检测stat3和survivin基因mRNA的表达实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素(20,40,80 μmol/L)组. 细胞处理同上. 收集48 h细胞，用EZ Spin Column提取细胞总RNA, Real Time RTPCR反应参照试剂说明书进行.

　　1.2.4Western Blot检测pstat3，survivin蛋白的表达实验分为阳性对照组、槲皮素(20, 40, 80 μmol/L)组. 细胞处理同上. 48 h后收集各组细胞, RIPA (含1 mmol/L PMSF)液裂解后抽提总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度. 取变性蛋白样品50 μg上样,SDSPAGE电泳后转PVDF膜,半干标准转膜45 min. 漂洗后,加入Western封闭液4℃封闭过夜. 吸尽封闭液,1∶1000稀释pstat3和survivin兔多克隆一抗,4℃孵育过夜,回收一抗,加入Western洗涤液洗涤3次. 吸尽洗涤液,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1︰3000),4℃孵育1 h,回收二抗, Western洗涤液洗涤3次. ECL发光法进行Western检测. 采用Image pro plus软件进行杂交信号累计吸光度(IOD)分析.

　　统计学处理: 计量资料采用x±s,统计软件采用SPSS11.5分析,多个样本均数比较采用方差分析,两两比较用Dunnett检验,两变量间关系分析采用直线相关分析法.

　　2结果

　　2.1槲皮素抑制SGC7901细胞的增殖20～160 μmol/L槲皮素对胃癌SGC7901细胞的增殖均有抑制作用,且有随作用时间延长而抑制作用增强、随浓度增高抑制率增高的趋势(图1).

　　aP<0.05 vs 空白对照.

　　图1槲皮素(Que) 对SGC7901细胞的抑制作用(略)

　　2.2槲皮素诱导SGC7901细胞的凋亡处理48 h后,SGC7901细胞呈现典型的凋亡改变. 流式细胞仪检测显示,槲皮素(40 μmol/L)组细胞早期凋亡率为61.93%,阳性对照组早期凋亡率为62.80%,均明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P均=0.000).

　　2.3Real Time RTPCR检测SGC7901细胞stat3, survivin mRNA的表达胃癌SGC7901细胞株高表达stat3 mRNA和survivin mRNA(图2). 槲皮素(40 μmol/L)作用细胞48 h后,stat3和survivin的mRNA表达均明显下调,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P=0.029，P=0.020). 阳性对照组也有相似表现，差异有统计学意义(P=0.005, P=0.034). 经统计分析，stat3和survivin的mRNA表达存在直线相关关系(r=0.697，P=0.002).

　　2.4Western Blot法检测SGC7901细胞pstat3和survivin蛋白的表达SGC7901细胞高表达pstat3和survivin蛋白(图3). 作用细胞48 h后,阳性对照AG490使pstat3和survivin蛋白表达水平显著下调. 槲皮素(40 μmol/L)组pstat3和survivin蛋白表达水平均出现与阳性对照相似的显著下调，差异无统计学意义(P=0.988，P=0.999). 经统计两种蛋白的表达存在直线相关关系(r=0.748, P=0.003).

　　图2Real Time RTPCR检测48 h SGC7901细胞stat3, survivin mRNA的表达(略)

　　A: pStat3(Mr 86 000); B: Survivin (Mr 16 500); C: GAPDH (Mr 37 000). 1: AG490 40 μmol/L; 2: 槲皮素20 μmol/L; 3: 槲皮素40 μmol/L; 4: 槲皮素80 μmol/L.

　　图3Western Blot检测48 h SGC7901细胞pstat3和survivin蛋白的表达(略)

　　3讨论

　　Survivin是近来发现的一种结构特殊的抗凋亡因子,在多种肿瘤组织中广泛表达,与肿瘤的发生、发展和预后密切相关,并可能是导致肿瘤细胞耐药性的因素[3-4]. 减少survivin的表达,可使肿瘤细胞的恶性增殖得到抑制.目前,survivin在肿瘤细胞中的上游调控机制、尤其是信号转导通路的调控机制研究甚少.

　　Stat3是转录信号传导子与激活子家族(signal transducers and activators of transcription, STATs)的重要成员,目前定义为癌基因. Stat3信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关,该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化. 研究显示在人类多种肿瘤组织与细胞系中[5-8],stat3异常表达或活性增强,提示stat3调控异常与肿瘤发生发展密切相关. 理论上，阻断肿瘤细胞中stat3信号传导通路就有可能起到治疗肿瘤的作用[2].

　　本实验中,槲皮素作用于人胃腺癌 SGC7901细胞后,细胞增殖受到明显抑制,作用呈现时间剂量依赖性;FCM检测结果表明槲皮素能够诱导SGC7901细胞凋亡. Real Time RTPCR及Western Blotting结果显示:在SGC7901细胞中,stat3 mRNA及其蛋白活化形式pstat3呈高表达, 提示在细胞中stat3呈激活状态;而survivin mRNA和survivin蛋白也均呈高表达. 槲皮素作用后,stat3，mRNA和survivin mRNA的表达明显下降,两者之间存在直线相关关系;pstat3和survivin蛋白质表达亦显著降低,两者之间也呈直线相关关系. 我们推论: 槲皮素很可能是通过下调stat3 mRNA的表达及stat3蛋白的磷酸化水平,从而导致了survivin mRNA及survivin蛋白的表达下调,进而诱导SGC7901细胞凋亡.通过对stat3,survivin基因的深入研究,必将有利于肿瘤发生机制的阐明,并为肿瘤的诊疗提供一定的理论依据及两种理想的肿瘤标记物和靶器.

　　【参考文献】

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