聚乙二醇干扰素α-2a治 疗慢性丙型肝炎患者程序性死亡受体-1和 Toll 样受体3与4的表达及其意义

HCV感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌,对患者的健康和生命危害极大,已成为严重的社会和公共卫生问题。慢性丙型肝炎病毒感染者的细胞免疫功能低下与HCV持续感染以及抗病毒治疗效果欠佳有关囫。外周血中程序性死亡受体-1主要诱导表达于活化的淋巴细胞表面,在T、B淋巴细胞的免疫应答中起负向调控作用。大量研究结果证实,PD-1高表达与T淋巴细胞数量耗竭及功能低下关系密切。Toll样受体3、TLR4能够识别病原相关分子模式,在细胞活化信号转导中起重要作用,是联系固有免疫与获得性免疫的桥梁。干扰素是通过调节患者免疫细胞活性而达到抗病毒治疗作用的一类小分子物质,在其治疗慢性HCV感染者的过程中,PD-1、TLR3、TLR4是否出现变化及其临床意义,这些表面受体对免疫细胞是否可能存在协同作用,值得进一步研究。我们以聚乙二醇干扰素(PegIFN)α-2a联合利巴韦林治疗的初治慢性丙型肝炎患者为研究对象,观察多个时间点患者外周血单个核细胞表面PD-1、TLR3、TLR4表达率的变化,进一步分析了PBMC上PD-1、TLR3、TLR4的表达率与患者出现持续病毒学应答的相关性。　　资料与方法　　1.研究对象:选取2009年9月至2011年9月在本院就诊的基因I型HCV感染慢J眭丙型肝炎患者,诊断符合《丙型肝炎防治指南》;在入组前未经任何抗病毒及免疫抑制治疗。排除标准:合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、遗传代谢性肝病以及酒精和药物所致肝损害;肝硬化或者肝癌患者;合并心、脑、肾、血液及内分泌等系统严重疾病。所有研究对象均签署知情同意书,获得本院伦理委员会同意并备案。另选取门诊体检的正常人作为对照。　　2.研究方法:人选患者均接受48周的Peg-IFNα-2a治疗,180ug/周,皮下注射。联合口服利巴韦林15ug·kg-1·d-1。分别在6个时间点进行随访和检测:基线(0周)与治疗4、12、24、48周及停药后随访到”周,详细记录患者的症状、体征,同时进行血常规、肝功能、HCVRNA定量和PBMC上PD-1、TLR3、TLR4表达率的检测。　　3.分组标准:SVR组:治疗48周结束后,随访6个月到72周时,HCVRNA(PCR法)仍持续阴J眭;非SVR组:治疗鲳周结束时HCⅤRNA仍能被检测到或者治疗结束时HCⅤRNA阴转,但随访到72周时,HCⅤRNA(PCR法)又能被检测到。　　4.主要试剂:异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人PD△单克隆抗体及相应同型对照抗体FITCMouseIgG购自美国BD公司,藻红蛋白(PE)标记的抗人TLR3抗体、别藻青蛋白(APC)标记的抗人TLR4抗体及相应的同型对照抗体均购自美国Biolegend公司。人淋巴细胞分离液购自美国Promega公司。血清HCVRNA水平检测试剂AmplifiierCoBAs购自瑞士罗氏公司,检测最低值为15IU/ml。　　5.PBMC分离:分别采集研究对象静脉血10ml,肝素钠抗凝,密度梯度离心法分离PBMC;取适量锥虫蓝染色,细胞活力>95%后计数,分离的PBMC(2×10的6次方个)加入1ml细胞冻存液,置-80℃保存备用。　　6.流式细胞术检测细胞表面PD-1、TLR3、TLR4的表达:复苏各研究对象在不同时间点的PBMC各1管,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,采用直接标记法分别加入下列流式抗体:FITC-PD-1单克隆抗体、PE-TLR3抗体、APC-TLR4抗体,以相应的同型对照抗体标记细胞作为阴性对照。置于4℃、避光条件下孵育30min,PBS洗涤2次,流式细胞仪分析PBMC上的PD-1、TLR3、TLR4表达率。　　7.临床疗效观察:研究对象在治疗随访期间,在各时间点检测ALT、HCVRNA及血常规等临床疗效指标,并详细记录患者临床症状、体征改善情况。其中,HCVRNA应用罗氏AmplifiierCoBAs检测,ALT、血常规在本院门诊检验科由专人检测。　　8.统计学方法:采用SPSS16.0统计软件储存和分析数据。常规进行方差齐性检验和正态性检验,计量资料数据以均数±标准差表示。多组资料之间的比较采用onewayANOVA模块进行t检验;两组之间比较采用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。　　结果　　1.一股资料:共选慢性丙型肝炎患者23例,其中男性13例,女跬10例,年龄21~60(40.4±9.9)岁,ALT异常[(87.5±90.2)U/L];正常体检者10名。　　2.临床转归:随着治疗时间的延长,HCVRNA下降至检测水平以下的例数逐渐增多,治疗第4周时有15例,第12周时18例,第24周时20例。第48周有3例患者HCVRNA水平出现病毒学反跳.23周时有4例患者出现病毒学反跳。”例患者中有16例达到SVR,进人SVR组;7例患者未达SVR,进入非SVR组。比较基线时两组患者HCVRNA和ALT水平,差异无统计学意义。SVR组HCVRNA和ALT水平随着治疗时间延长逐步下降;非SVR组HCVRNA水平在整个治疗和随访期间一直处于较高水平,ALT水平在4~12周有明显下降,但24周后又有所升高;SVR组和非SVR组比较:ALT水平在24周和72周差异有统计学意义(t值分别为7.946,2.882,P值均<0.05);HCVRNA水平在48周和72周差异有统计学意义(t值分别为2.589,2.172,P值均<0.05)。　　3.正常人与HCV患者基线PBMC上PD-1、TLR3、TLR4表达率的比较:10名正常人与23例慢性丙型肝炎初治患者治疗前的PBMC上PD-1、TLR3、TLR4、PD1/TLR3、PD1/TLR4阳性细胞比率。与正常人比较:慢性丙型肝炎初治患者治疗前PD-1、TLR4、PD1/TLR4在PBMC上的表达率显著增高,差异有统计学意义(t值分别为4.675,5.148,2.549，P值均<0.0,1)。　　4.Peg-IFN-α-2a治疗和随访期间PBMC上PD-1、TLR3、TLR4表达率的变化:治疗前23例慢性HCⅤ感染者PBMC表面PD-1的表达率较高,平均为45.44%±7.32%。随着Peg-IFN-α-2a治疗时间的延长,PD-1的表达逐渐下降,48、72周PD-1在PBMC上的表达率显著下降,分别为27.13%±11.81%、32.66%±21.61%,明显低于治疗前水平(0周),且差异有统计学意义(t值分别为3.468,2.759,P值均<0.05)。TLR3在治疗前处于较低水平,平均为12.12%±5.23%。随着治疗和随访时间延长,TLR3水平缓慢升高,12周到”周各时间点的TLR3水平与治疗前的差异有统计学意义(t值分别为-2.376,-2.121,-3.739，-5.974，P值均<0.01)在72周TLR3在PBMC上表达阳性率升高至25.91%±5.58%,达到各观察点的最高水平。TLR4在PBMC表面的表达率随着治疗和随访时间延长有逐渐下降的趋势。与治疗前(57.74%%±15.45%)比较,24~72周TLR4的表达率分别为46.39%±13.90%、11.02%±5.56%、17.21±5.82%,差异有统计学意义(t值分别为2.015,10.477,8.174，P值均<0.05)。　　进一步对PBMC上PD1/TLR3和PD1/TLR4共表达的情况分析显示:PD1和TLR4同时表达的PBMC随着治疗和随访时间延长逐渐下降,与治疗前(35.42%±7.97%)比较,12~72周时共表达PD1和TLR4的PBMC比率明显下降,差异有统计学意义(t值分别为3.194,3.754,5.126，4.759，P值均<0.01)PD1/TLR3在PBMC上的共表达率在各观察时间点的差异无统计学意义。　　5.SVR与PBMC表面PD-1、TLR3、TLR4表达率的相关性:在Peg-IFN-α-2a治疗和随访期间SVR组与非SVR组患者PBMC上PD-1、TLR3、TLR4表达情况比较,在0、72周时PD-1在两组的表达率差异有统计学意义(P=0.03;P=0.002)。SVR与非SVR组患者在12~72周的TLR3表达率差异均存在统计学意义(P=0.023;P=0.047;P=0.041;P=0.045),且随治疗时间延长都有升高的趋势。TLR4表达率在各时间点的差异无统计学意义。　　讨论　　近年发现的PD-1被认为是影响自身免疫和感染性疾病慢性化的重要受体之一,参与获得性免疫的负向调控过程。PD-1在外周血中表达于活化的CD4+、SD8+T、B淋巴细胞以及单核细胞表面,与免疫细胞的程序性死亡和功能低下密切相关。慢性丙型肝炎患者外周血CD4+及SD8+T淋巴细胞上PD-1阳性表达率明显高于其他非病毒性肝病患者及健康对照。慢性丙型肝炎患者产生I型细胞因子的能力明显降低,阻断PD-1共刺激信号途径能够增强HCV感染者T淋巴细胞分泌I型细胞因子的能力。　　提示:PD1与慢性HCV感染者体内HCV特异性T淋巴细胞功能状态密切相关。　　TLRs信号转导主要通过MyD88依赖性和MyD88非依赖性两种途径,激活炎症的主要调节物NF-ΚB、丝裂原活化蛋白激酶和IFNβ,引起多种细胞因子的释放,同时上调抗原提呈细胞表面CD80(B7-1)、CD86(B7-2)等共刺激分子,并最终激活特异性免疫系统。Wang等通过体外细胞实验发现HCV与TLR3的相互作用可能是引起HCV感染和HCV在体内持续感染的重要决定因素。在慢性丙型肝炎患者,PBMC中TLR2和TLR4的高表达可促进下游细胞因子的产生,从而增加了免疫病理风险,导致过度的炎症反应和组织损伤。HCV感染外周血B淋巴细胞后,TLR4的表达亦提高3~7倍,并在Raji细胞中得到进一步证实。HCV非结构蛋白NS5A转染HepG2细胞后可导致其TLR4的表达显著提高。而在小鼠模型中,HCVNS5A诱导TLR4表达上调,活化的TLR4可直接激活Nanog的启动子,促进其转录、表达,共同参与促进肝损伤和肝癌的形成。　　本研究结果显示:Peg-IFN-α-2a治疗前慢性HCV感染者PBMC表面PD-1的表达率较高,随着治疗时间的延长表达率逐渐下降,在48、72周时,PD-1在PBMC上的表达率显著下降,明显低于治疗前水平(P<0.05)。TLR3在治疗前处于较低水平,随着治疗和随访时间延长表达率升高,在治疗12~48周,TLR3水平均明显高于治疗前(P<0.05);且在停药后24周,TLR3的表达阳性率继续升高至各观察点的最高水平。而TLR4在PBMC表面的表达率随着治疗和随访时间延长有逐渐下降的趋势。对治疗前后PBMC上的PD1/TLR3和PD1/TLR4共表达情况分析显示:PD1和TLR4同时表达的PBMC比率随着治疗和随访时间延长逐渐下降,与治疗前比较,12~48周时间点共表达PD1和TLR4的PBMC比率明显下降(P<0.01)。PD-1与TLR3共同表达的PBMC比率在治疗前后的变化不明显。本研究结果提示,Peg-IFN-α-2a治疗可以上调HCV感染者PBMC上TLR3的表达,下调TLR4及TLR3的表达,这可能是其发挥抗病毒作用的机制之一。　　本研究结果还显示:SVR组PD1的表达在0、72周时显著低于非(P<0.05)。。同时,TLR3在12~72周时在PBMC上升高的幅度在SVR组明显高于非SVR组(P<0.05)。说明Peg-IFN-α-2a持续的抗HCV作用可能与慢性HCV感染者PBMC上PD-1的持续低水平有一定相关性;同时,该结果也提示TLR3信号途径与干扰素的远期疗效有一定相关性。　　总之,慢性丙型肝炎患者在Peg-IFN-α-2a治疗期间,外周血免疫细胞上PD1的表达有显著下降趋势,天然免疫受体TLR3表达升高、TLR4表达降低。这些淋巴细胞表面受体的变化可能与患者干扰素治疗后免疫细胞的功能恢复有关。并且,干扰素抑制病毒作用的持续性与患者体内PBMC上的PD-1、TLR3的表达相关,这种变化是HCV复制被抑制的结果,还是干扰素本身的调控结果,目前仍不得而知,值得进一步研究。　　参考文献　　1.中华医学会肝病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志,2004,(4):194-198.　　2.高得勇,张欣欣.丙型肝炎免疫发病机制的研究进展[J].国际流行病学传染病学杂志,2006,(1):61-64.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4149.2006.01.018.　　3.CherL.Co-inhibitorymoleculesoftheB7-CD28familyinthecontrolofT-cellimmunity[J].NatureReviewsImmunology,2004.336-347.　　4.PetrovasC,CasazzaJP,BrenchleyJM.PD-1isaregulatorofvirus-specificCD8+TcellsurvivalinHIVinfection[J].JournalofExperimentalMedicine,2006.2281-2292.　　5.HaSJ,MuellerSN,WherryEJ.EnhancingtherapenticvaccinationbyblockingPD-l-mediatedinhibitorysignalsduringchronicinfection[J].JournalofExperimentalMedicine,2008.543-555.　　6.张红梅,余伍忠.Toll样受体与病毒性肝炎相关性的研究进展[J].中国现代医学杂志,2011,(20):2407-2411,2414.　　7.AkiraS,UematsuS,TakeuchiO.Pathogenrecognitionandinnateimmunity[J].Cell,2006.783-801.　　8.WangN,LiangY,DevarajS.Toll-likereceptor3mediatesestablishmentofanantiviralstateagainsthepatitisCvirusinhepatomacells[J].JournalofVirology,2009,(19):9824-9834.doi:10.1128/JVI.01125-09.　　9.WangJP,ZhangY,WeiX.CirculatingToll-likereceptor(TLR)2,TLR4,andregulatoryTcellsinpatientswithchronichepatitisC[J].ActaPathologica,MicrobiologicaEtImmunologicaScandinavica,2010.261-270.　　10.闻名,肖新强,龚国忠.丙型肝炎病毒NSSA在肝癌细胞对TLR4表达的影响[J].临床肝胆病杂志,2011,(1):49-52.　　11.MachidaK,TsukamotoH,MkrtchyanH.Toll-likereceptor4mediatessynergismbetweenalcoholandHCVinhepaticoncogenesisinvolvingstemcellmarkerNanog[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA),2009.1548-1553.