Caspase-9和Bax在胃癌组织中的表达及其意义

　　作者：潘科,于敬达,刘丽娜　　作者单位：1.黔南州人民医院消化内科，贵州黔南 558000;2.包头医学院医学技术系;3.大连医科大学第一附属医院消化内科

　　【摘要】 目的：探讨凋亡基因Caspase-9和Bax在胃癌中的表达与意义。方法：应用免疫组化S-P法检测Caspase-9和Bax在57例胃癌及48例非癌胃黏膜组织中的表达。结果：Caspase-9蛋白在胃癌组织中阳性表达率为40.35 %，非癌胃黏膜组织的阳性表达率70.83 %，两组比较差异有统计学意义(P<0.05);Bax蛋白在胃癌组织中阳性表达率为35.09 %，非癌胃黏膜组织阳性表达率为72.92 %，两组比较差异有统计学意义(P<0.05);高中分化腺癌组Caspase-9和Bax蛋白的阳性表达率明显高于低分化腺癌组及粘液癌组，两者间差异有统计学意义(P<0.05);Bax和Caspase-9蛋白在胃癌组织中的表达与淋巴结转移、浸润深度、临床病理分期均无明显关系(P>0.05);在胃癌组织Caspase-9表达阳性的23例中有Bax表达阳性17例，在胃癌组织Bax表达阴性37例中Caspase-9表达阴性31例，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Caspase-9和Bax在胃癌组织中表达降低，提示二者可能与胃癌的发生或发展相关;随着胃癌分化程度的降低，Caspase-9和Bax的表达降低，提示二者可能与胃癌的恶性程度有关;胃癌组织中Caspase-9和Bax表达有关，推测Bax激活Caspase-9的线粒体通道受抑可能参与胃癌的发生。

　　【关键词】 Caspase-9,Bax,胃癌,免疫组织化学

　　Abstract Objective： To explore the expression of Caspase-9 and Bax in gastric carcinoma and their significance. Methods: Immunohistochemistry SP was used to detect the expression of Caspase-9 and Bax in 57 patients with gastric carcinoma and 48 patients without gastric carcinoma. Results: The positive expression of Caspase-9 protein in gastric carcinoma was 40.35 %, which was significantly lower than that (70.83 %) in those without gastric carcinoma (P<0.05). The positive expression of Bax protein in gastric carcinoma was 35.09 %, significantly lower than that (72.92 %) in those without gastric carcinoma (P<0.05). The positive expression of Caspase-9 and Bax protein in well and moderately differentiated adenocarcinomas was significantly higher than that in poorly differentiated adenocarcinoma and mucinous carcinoma (P<0.05). The expression of Caspase-9 and Bax protein was not correlated with lymph node metastasis, depth of invasion, and clinical stages in gastic carcinoma. In 23 cases in which Caspase-9 expressed positive in gastic carcinoma, 17 cases showed the positive expression of Bax. In 37 cases in which Bax expressed negative in gastic carcinoma, 31 cases presented Caspase-9 negative expression. Caspase-9 is associated with Bax (P<0.05). Conclusion: Caspase-9 and Bax protein expression is lower in patients with gastric carcinoma, which may be related to the occurrence and development of tumor. Caspase-9 and Bax protein became lower with the decrease of tumor malignancy, which may be related to malignancy or benignity of the tumor. In gastric carcinoma, Caspase-9 and Bax expression had the obvious relevance. We extrapolate that the suppression of Bax activating Caspase-9 plastochondria channel possibly takes part in the gastric carcinoma occurrence.

　　Key words Caspase-9; Bax; Gastric carcinoma; Immunohistochemistry

　　Caspase-9位于级联反应上游，是最重要的起始因子之一，在其他蛋白参与下发生自我激化并激活下游的Caspase因子，然后引起级联放大效应，从而导致细胞的凋亡。Bax又称Bcl-2同源拮抗蛋白/致死蛋白，是Bcl-2家族的一个成员，Bax既可形成同聚体促进凋亡，又可以与Bcl-2形成杂二聚体抑制后者的抗凋亡效应，Bax促进细胞凋亡的主要机制是诱导细胞色素C从线粒体释放至细胞浆，与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)结合，然后激活Caspase-9启动凋亡级联反应，导致细胞凋亡。本研究应用免疫组化S-P法检测Caspase-9和Bax在不同胃黏膜组织的表达，初步探讨Caspase-9和Bax在胃癌的发生发展中的作用及意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 收集大连医科大学第一附属医院2005年10月至2006年8月因上消化道症状行胃镜检查的胃癌及非癌胃黏膜标本105例，其中胃癌组57例，非癌胃黏膜组48例，均经病理组织学证实。胃癌组男性42例，女性15例，年龄37～85岁，平均年龄64.07岁。其中高中分化腺癌14例、低分化腺癌34例、粘液癌9例。所有对象受检前均未经放疗、化疗等治疗。非癌胃黏膜组男性34例，女性14例，年龄41～85岁，平均年龄64.10岁。活检标本经10 %中性福尔马林溶液中固定，48小时后常规石蜡包埋，连续切片(切片先用多聚赖氨酸处理)，切片厚4μm。胃癌组追踪手术及临床资料，肿瘤分期采用1987年国际抗癌联盟胃癌TNM分期。

　　1.2 免疫组织化学检测 Caspase-9兔抗人多克隆抗体(即用型)、Bax鼠抗人单克隆抗体(即用型)、S-P试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。染色步骤按说明书进行。阳性对照为已知表达阳性的组织切片，以PBS代替一抗作为阴性对照。Caspase-9蛋白以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，Bax蛋白以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片在400倍显微镜下观察整体染色情况，选择有代表性的区域，随机读取100个细胞，阳性细胞率=(阳性细胞数/总细胞数)×100 %。切片中阳性细胞率≥5 %为阳性病例，<5 %为阴性病例。

　　1.3 统计学方法 用SPSS 12.0软件对所有数据进行统计分析。检验方法用χ2检验、确切概率法统计分析数据，P<0.05(双侧)认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Caspase-9和Bax在胃癌和非癌胃黏膜组织中的表达 Caspase-9蛋白在57例胃癌组织中有23例阳性表达，阳性表达率为40.35 %;48例非癌胃黏膜组织中有34例阳性表达，阳性表达率为70.83 %，两者相比差异有统计学意义(χ2=9.76，P<0.05)。Bax蛋白在57例胃癌组织中有20例阳性表达，阳性表达率为35.09 %，48例非癌胃黏膜组织中有35例阳性表达，阳性表达率72.92 %，两者差异有统计学意义(χ2=14.95，P<0.05)。

　　2.2 Caspase-9和Bax与胃癌组织学类型的关系 高中分化腺癌Caspase-9的阳性表达率明显高于低分化腺癌及粘液癌，两者间差异有统计学意义(P<0.05);低分化腺癌的Caspase-9阳性表达率略低于粘液癌，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。Bax蛋白在高中分化胃癌的表达率明显高于低分化胃癌及粘液癌(P<0.05);低分化腺癌Bax的阳性表达率略低于粘液癌，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 Caspase-9和Bax与胃癌淋巴结的关系 Caspase-9和Bax蛋白的表达与胃癌淋巴结是否转移间差异无统计学意义(P>0.05)，即二者无明显关系，见表3。表3 Caspase-9和Bax与胃癌淋巴结的关系

　　2.4 Caspase-9和Bax与胃癌临床分期的关系 Caspase-9和Bax蛋白的表达与胃癌临床分期间差异无统计学意义(P>0.05)，即二者无明显关系。

　　2.5 Caspase-9和Bax与胃癌浸润深度的关系 Caspase-9和Bax蛋白的表达与胃癌浸润深度间差异无统计学意义(P>0.05)，即无明显关系。

　　2.6 胃癌组织中Caspase-9和Bax的相关性 在胃癌组织Caspase-9表达阳性的23例中有Bax表达阳性者17例，在胃癌组织Bax表达阴性37例中Caspase-9表达阴性31例，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨论

　　细胞凋亡(Apoptosis)是一种为基因所调控的自主性的有序死亡过程。目前人们已认识到肿瘤的发生不仅与细胞的异常增生、分化停滞有关，且与细胞凋亡失衡密切相关。细胞凋亡分子机制的深入研究已经发现，凋亡的激活存在两条途径，其中重要的一条为内源性途径(也称为线粒体途径)，此途径中激活Caspase酶是凋亡过程中的关键步骤[1]。

　　Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族，该家族在氨基酸序列、结构及酶的特性上均相似，通常情况下以无活性的酶原形式存在于细胞中，酶原分子激活后，大小亚基解离并重新组装为四聚体形式的活性酶，由于Caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡过程一旦触发，即呈级联放大效应。Caspase-9位于级联反应上游，当凋亡起始信号作用于线粒体后，引起线粒体释放细胞色素C(Cyt-c)，接着Cyt-c与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)结合并使Apaf-1改变构象形成八聚体，后者与Caspase-9结合并诱导其发生自我催化，活化的Caspase-9进一步激活下游的Caspase，使级联反应进一步放大[2]，因此Caspase-9是细胞线粒体依赖的凋亡途径中重要起始因子。Bax是Bcl-2基因家族中的一员，Bax既可形成同聚体促进凋亡，又可与Bcl-2形成杂二聚体抑制后者的抗凋亡效应[3]。Bax促进细胞凋亡主要是通过加速线粒体中的Cyt-c释放和增加Caspase的活性来实现的。

　　本研究结果显示，Bax在胃癌组织中的阳性表达率为35.09 %，明显低于在非癌胃黏膜组织中的阳性表达率72.92 %(P<0.05),此结果与文献[4-5]报道一致，提示在胃癌发生过程中可能有促凋亡基因Bax的参与。Gil等[6]研究发现，胃癌、结肠癌中常发生Bax基因169号密码子错义突变，其错义突变将导致Bax蛋白分子中苏氨酸被丙氨酸或蛋氨酸替换，从而蛋白抑制细胞凋亡能力降低，进一步引起肿瘤的发生、发展。Caspase-9在胃癌组织中的阳性表达率为40.35 %，明显低于在非癌胃黏膜组织中的阳性表达率70.83 %(P<0.05)。Park等[7]研究人胃癌细胞株的凋亡时发现，Caspase-9在胃癌细胞的凋亡过程中发挥重要的作用。Caspase-9蛋白低表达时细胞凋亡受到抑制的机制可能是Caspase-9蛋白表达下降，其激活下游Caspase因子的能力降低，从而使细胞凋亡减少，细胞凋亡和增殖平衡被打破，胃癌则可能发生。

　　本实验观察到Bax和Caspase-9蛋白在高中分化胃癌的表达率明显高于低分化胃癌及粘液癌(P<0.05),我们认为癌组织中Bax和Caspase-9通过促进癌细胞凋亡而使恶性程度降低，Bax和Caspase-9随着分化降低而表达减少，是肿瘤异常分化的结果。

　　本实验观察到Bax和Caspase-9蛋白在胃癌组织中的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度、临床病理分期均无明显关系(P>0.05)，尚不能用它们作为判断胃癌预后的指标。Bax和Caspase-9蛋白与临床病理特征之间的关系文献报道不一[5，8-9]，不同实验者的结果不一致可能与不同研究所取的标本存在系统误差和判断标准不一致有关。

　　我们还发现二者在胃癌组织中表达有显著相关性，均呈现低表达，有研究发现在前列腺细胞癌的诱导凋亡基因治疗过程中，Bax基因主要通过线粒体途径激活Caspase，继而产生明显的细胞凋亡[10]。因此我们推测胃癌细胞中促凋亡基因Bax激活Caspase-9的线粒体途径受到抑制，可能参与胃癌发生发展过程。

　　【参考文献】

　　[1] Kumar S,Vaux DL. Apoptosis.A Cinderella caspase takes center stage[J].Science,2002,297(5585):1290-1291.

　　[2] Ayman S,Srinivasa MS, Samir A,et al.Cytochromec and dATP-mediated oligomerization of apaf-1 is a prerequisite for procaspase-9 activation[J].The Journal of Biological Chemistry,1999,274(25):17-18.

　　[3] Kelekar A,Thompson CB.Bcl-2-family proteins:the role of the BH3 domain in apoptosis[J].Trends Cell Biol,1998,8(8):324-330.

　　[4] 徐佶,张一楚,孙久运,等.Bcl-2,bax,Ki-67在胃癌中的表达及意义[J].肿瘤,2001,21(3):211-212.

　　[5] 岑延增，罗云生,孙涛,等.细胞凋亡相关基因bcl-2与bax在胃癌组织中表达探讨[J].广西医科大学学报,2005,2(22):206-209.

　　[6] Gil J,Yamamoto H,Zapata JM,et al.Impairment of the proapoptotic activity of Bax by missense mutations found in gastrointestinal cancers[J].Cancer Res,1999,59(9):2034-2035.

　　[7] Park IC,Park MJ, Hwang CS,et al.Mitomycin C induces apoptosis in a caspase-dependnt and Fas/CD95-independent manner in human gastric adenocarcinoma cells[J].Cancer Lett,2000,158(2):125-132.

　　[8] Komatsu K,Suzuki S,Ohara S,et al. Expression of bcl-2 and bax in human gastric cancer tissue[J].Nippon Rinsho,1996,54(7):1927-1934.

　　[9] 贾百灵,李继昌,张和平,等.Fas、Bax表达及细胞凋亡与胃癌浸润及转移的关系[J].实用癌症杂志,2000,15(3):238-240.

　　[10] Li X,Marani M,Yu J,et al.Adenovirus-mediated Bax overexpression for the induction of therapeutic apoptosis in prostate cancer[J].Cancer Res,2001,61(1):186-191.