大蒜素对胃上皮细胞Cx37、Cx43 mRNA表达及细胞间隙连接通讯功能的影响

　　作者：罗小玲，徐灿霞△，胡 琳 作者单位：410013 湖南长沙，中南大学湘雅三医院消化内科(△通迅作者)

　　【摘要】目的 观察体外实验中大蒜素对胃上皮细胞系MGC-803 Cx 37 mRNA、Cx 43 mRNA表达及细胞间隙连接通讯功能的影响。方法 终浓度为3 μg/ml、6 μg/ml、9 μg/ml、12μg/ml大蒜素分别加入胃上皮细胞MGC-803培养 24 h、48 h、72 h，同时设立不加药物的阴性对照，用RT-PCR法检测细胞Cx 37 mRNA、Cx 43 mRNA表达，LY染料传输方法检测细胞间隙连接通讯功能。结果 MGC-803细胞Cx 37 mRNA有表达，Cx 43 mRNA无表达，GJIC功能弱，加入不同浓度大蒜素后，Cx 37 mRNA表达和细胞间隙连接通讯功能增强，Cx 37 mRNA表达随大蒜素浓度和培养时间的增加而增强(均P<0.05)，Cx 43 mRNA仍无表达。 结论 大蒜素在转录水平上调胃上皮细胞MGC-803 Cx 37基因的表达，改善细胞间隙连接通讯功能。

　　【关键词】 大蒜素;胃上皮细胞;细胞间隙连接通讯功能

　　Effects of allicin on expression of connexin 37，connexin 43 mRNA and gap junction intercellular communication of gastric epithelial cells

　　LUO Xiao-Ling，XU Can-Xia，HU Lin.Department of Gastroenterology，The Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410013，China

　　[Abstract] Objective To observe the effects of allicin on the expression of connexin 37 mRNA，connexin 43 mRNA and gap junction intercellular communication of gastric epithelial cells MGC-803 in vitro.Methods MGC-803 cell were interfered with various concentration allicin(3，6，9，12 μg/ml ) for 24，48 and 72 hours respectively and control groups with no intervention.RT-PCR method was applied to detect the expression of connexin 37 mRNA，connexin 43 mRNA in cells.Lucifer Yellow Scrape-loading and dye transfer method was applied to detect gap junction intercellular communication.Results MGC-803 cell expressed Cx 37 mRNA，it didn’t express Cx 43 mRNA.Cell gap junction intercellular communication was weak in MGC-803 cell.The expression of Cx 37mRNA and gap junction intercellular communication was enhanced after interfered with variable dose allicin.The expression of Cx 37mRNA was up-regulated with the increasement of concentration and action time of allicin (P<0.05).There was still no Cx 43 mRNA expression in MGC-803 cell.Conclusion Allicin can up-regulate expression of Cx 37 in MGC-803 cell at the transcription level，increase GJIC function.

　　[Key words] allicin;gastric epithelial cell;gap junction intercellular communication

　　细胞间隙连接通讯(GJIC)功能在控制细胞生长和保持细胞数量稳态方面具有重要的作用[1]。肿瘤细胞GJIC功能的缺失总是伴随着特定的组织特异性间隙连接蛋白基因(Cx基因)表达的下调。Cx是GJIC的结构基础，连接蛋白和GJIC 功能的异常与肿瘤发生、发展密切相关。大量研究资料表明，Cx基因在多种肿瘤细胞表达下降或消失[2]，许多促癌剂和某些活化的癌基因可使Cx基因表达降低，下调GJIC，间接证明了Cx基因及GJIC的下调与肿瘤进展有关[3]。因此通过增加连接蛋白表达，改善和恢复细胞GJIC抑制，将对肿瘤有重要作用。大蒜素(allicin) 又名大蒜新素，可促进BGC-823胃癌细胞间通讯的恢复。本研究观察大蒜素对胃上皮细胞MGC-803 Cx 37、Cx 43 mRNA表达及细胞间隙连接通讯功能的影响，进一步探讨大蒜素抗肿瘤的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 人胃低分化黏液腺癌细胞系MGC-803细胞，由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所提供。大蒜素注射液浓度为15 mg/ml，主要成分为二烯丙基三硫化合物，纯度大于99.5 %，购自上海禾丰制药厂。逆转录试剂盒购自Fermentas公司。RT-PCR引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。罗氏黄(Lucifer yellow)购自美国Sigma公司。

　　1.2 方法 (1)细胞培养和大蒜素干预:对数生长期的MGC-803细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，接种在24孔板和50 ml培养瓶内，细胞贴壁后弃去原有培养基，加入大蒜素和新鲜培养基使其终浓度分别为3、6、9、12 μg/ml，同时设立不加大蒜素的对照组，每组设3个重复孔。分别培养24、48、72 h。 (2)划痕标记染料示踪观察细胞的GJIC功能：接种细胞在24孔板内，PBS洗4次，弃净液体，细胞浸泡在含0.05% Lucifer Yellow (Sigma)的PBS液内，每孔500μl，用锐利刀刃轻轻划痕，放置3min，弃净液体，并以PBS洗4次，立即用倒置荧光显微镜观察摄像，KP490滤光片观察荧光染料传输情况。(3)RT-PCR法检测Cx 43 mRNA。Cx 37 mRNA 的表达：采用Trizol试剂提取细胞总RNA，合成基因引物Cx 43(277bp):5’-CTCGCCTATGTCTCCTCCTG-3’，5’-ACGACTGCTGGCTCTGCTTG-3’。Cx37(177bp)：5’-AGTGTGGGGTGACGAGCA A-3’，5’-CGCCGAGACAGGTAAATGA-3’。GAPDH(452bp):5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’。取RNA样品2μg按试剂盒操作程序进行逆转录，Cx 43、Cx 37PCR扩增：95 ℃ 2 min 30 s;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环;最后72℃延伸5 min;4 ℃保存。GAPDH：95 ℃ 2 min 30 s;94 ℃ 40 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共30个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。分别取5 μl扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。

　　1.3 统计学方法 实验数据均采用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 12.0软件进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞间隙连接通讯功能的变化 对照组MGC-803细胞间隙连接通讯功能较差，荧光染料只出现在划痕旁的单列细胞内，没有细胞间染料传输的现象。加大蒜素后荧光染料不仅出现在划痕附近的细胞内，而且在划痕以外的细胞内也出现了荧光染料，说明出现了细胞间染料传输的现象，细胞具有一定的间隙连接通讯功能，大蒜素能增加胃上皮MGC-803细胞GJIC功能，随大蒜素浓度增高，荧光染料从划痕边沿细胞向邻近细胞传递的距离逐渐增加(见图1)。

　　2.2 细胞Cx 37、Cx 43 mRNA表达 对照组MGC-803细胞Cx 43 mRNA无表达，Cx 37 mRNA有表达，大蒜素作用后Cx 43 mRNA仍无表达，Cx 37 mRNA的表达升高。不同浓度大蒜素作用MGC-803细胞24、48、72 h后，Cx 37/GAPDH光密度值较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01)，重复测量设计两因素多水平方差分析大蒜素不同浓度作用不同时间组间Cx37/ GAPDH光密度值存在差异(P<0.01)，随大蒜素浓度和作用时间的增加而升高。Cx 43基因仍无表达(见图2)。

　　图2 不同浓度大蒜素作用48 h对MGC-803细胞Cx 37 mRNA表达的影响

　　1、3、5、7、9分别为对照组、3 μg/ml组、6 μg/ml组、9 μg/ml组、12 μg/ml组GAPDH mRNA 条带;2、4、6、8、10为对照组、3 μg/ml组、6 μg/ml组、9 μg/ml组、12 μg/ml组，Cx 37 mRNA条带，Cx 37：177 bp，GAPDH：452 bp，M表示Mark

　　3 讨论

　　肿瘤细胞普遍存在GJIC功能的抑制或缺陷，GJIC功能抑制使癌细胞间和(或)癌细胞与正常细胞间信息传递受阻，使肿瘤细胞失去周围正常细胞的生长调控作用而无限增殖，最后导致肿瘤形成。多数肿瘤细胞间无GJIC功能，少数肿瘤细胞有较弱的GJIC功能，而临近正常组织和良性肿瘤间的GJIC功能正常[4]。GJIC的功能可以诱导，将外源性Cx基因转染入肿瘤细胞可诱发或增强GJIC功能，肿瘤细胞生长受到抑制[5，6]。诱导剂如绿茶提取物、类维生素A、类胡萝卜素、维甲酸等能上调Cx表达，诱发或增强GJIC功能[7]，目前诱导提高肿瘤细胞间隙联结通讯功能已经成为肿瘤治疗研究的新方向。

　　划痕标记染料示踪技术(SLDT)是一种检测各种培养细胞间隙连接通讯的方法，目前已广泛应用于细胞黏附和侵袭行为的检测。在荧光显微镜下观察，有GJIC功能的细胞其标记染料可沿划痕区向外扩散，通过测定荧光染料扩散的距离或划痕区的荧光强度，即可直接反映细胞的GJIC功能状况。胃癌MGC-803细胞不显示荧光染料的传播，表明无间隙连接通讯功能，证实人胃癌细胞通讯功能差。MGC-803细胞经大蒜素处理后在沿划伤细胞列和相邻的数列细胞内出现黄色荧光，随大蒜素浓度增高，荧光染料从划痕边沿细胞向邻近细胞传递的距离逐渐增加，提示大蒜素能促进细胞间隙连接通讯功能的恢复，与李晓光等[8]报道的大蒜油可促使胃癌细胞间通讯恢复结论一致，说明大蒜素可能通过恢复细胞间隙连接通讯功能从而抑制肿瘤细胞生长发挥抗肿瘤作用。

　　沈守荣等[9]报道Cx 37、Cx 43在胃正常上皮细胞高表达，胃癌细胞仅有Cx 43基因微弱表达，Cx 37无表达，人胃癌MGC-803细胞株中Cx37有一定的表达，Cx 43基因无表达。Cx表达可以诱导，施正专等[10]用维甲酸RA、佛波酯TPA、二甲基亚砜DMSO分别可诱导胃癌细胞MGC-803 Cx 43基因的较高水平表达。二烯丙基二硫(DADS)可增加鼠肝细胞的细胞间隙连接通讯功能，增加Cx 43蛋白的表达[11]。本结果显示MGC-803细胞经大蒜素处理后Cx 37 mRNA表达增强，随作用时间延长，Cx 37 mRNA增强越明显，且与大蒜素浓度呈正相关。

　　关于大蒜素抗肿瘤机制较复杂，大蒜素不仅能诱导肿瘤细胞凋亡和阻断致癌物的合成和诱导肿瘤细胞分化，而且调节机体免疫功能等，提示大蒜素抗肿瘤作用是通过多个途径完成的。本实验证实大蒜素在转录水平上调Cx 37基因在胃上皮细胞MGC-803的表达，恢复胃上皮细胞GJIC功能，提示大蒜素恢复细胞的GJIC可能与促进Cx 37的表达有关，大蒜素可通过上调GJIC功能进而调控细胞的增殖分化，证实GJIC是大蒜素抗肿瘤的靶点之一。

　　【参考文献】

　　1 Yamasaki H，Naus CG.Role of connexin genes in growth control.Carcinogenesis，1996，17:1199-1213.

　　2 Saito T，Nishimura M，Kudo R，et al.Suppressed gap junctional intercellular communication in carcinogenesis of endometrium.Int J Cancer，2001，93(3)：317-323.

　　3 Budunove IV，Carbajal S，Slaga TJ.Effect of diverse tumor promoters on the expression of gap-junctional proteins connexin (Cx) 26，Cx31.1 and Cx43 in sencar mouse epidermis.Moil Carcinog，1996，15:202-205.

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　　5 Carystinos GD，Katabi MM，Laird D，et al.Cyclic-AMP induction of gap junctional intercellular communication increases bystander effect in suicide gene therapy.Clin Cancer Res，1999，5(1):61-68.

　　6 Estin D，Li M，Spray D，et al.Connexins are expressed in primary brain tumors and enhance the bystander effect in gene therapy.Neurosurgery，1999，44(2):361-368.

　　7 Ren P，de-Feijter，AW，et al.Enhancement of liver cell gap junction protein expression by glucocorticoids.Carcinogenesis，1994，15(9):1807-1813.

　　8 李晓光，谢锦玉，李文梅，等.大蒜油对人胃癌细胞间通讯的影响.中国中医基础医学杂志，1998，4(2)：40-42.

　　9 沈守荣，李伏娥，刘洋，等.细胞连接蛋白基因在胃癌中的表达、诱导及突变研究.中华消化杂志，2000，20(5)：304-307.

　　10 施正专，沈守荣，邹益友，等.Cx基因在胃癌细胞中的表达及诱导分析.癌症，2000，19(5):423-425.

　　11 Huard C，Druesne N，Guyonnet D，et al.Diallyl disulfide (DADS) enhances gap-junctional intercellular communication by both direct and indirect mechanisms in rat liver cells.Carcinogenesis.2004，25(1):91-98.