Bmi1 基因在结肠癌中的过度表达及其临床意义

　　作者：徐丽姝 作者单位：广东省老年医学研究所消化科，广东 广州 510080

　　【摘要】目的 探讨结肠癌组织中Bmi1基因mRNA表达与结肠癌分化、转移及临床预后的关系。方法 收集我院2007年63例结肠癌手术的切除标本，提取肿瘤及癌旁组织配对标本的总RNA，用RTPCR方法测定Bmi1基因表达，并结合临床资料，对Bmi1基因差异表达与结肠癌病人临床表现的相关性进行分析。结果 63例配对标本分别进行Bmi1 mRNA荧光检测比较，44例标本的肿瘤组织中Bmi1基因mRNA表达明显高于癌旁正常结肠组织。Bmi1 mRNA的表达与结肠癌大小、淋巴结转移和浸润深度密切相关(P<0.05)，而与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度等无关(P>0.05)。 并且Bmi1 mRNA阳性表达者生存率明显低于阴性者。结论 Bmi1在结肠癌组织表达状态与结肠癌的生长和浸润转移关系密切，可以作为反映结肠癌生物学行为的有效指标。

　　【关键词】 结肠癌 Bmi 1 基因表达 临床意义

　　结肠癌病因不明，Bmi1基因(B cellspecific MLV integration site1)是目前研究的热门基因之一 。Bmi1基因属于多梳基因家族(PcG)成员，首次被提出是在转基因鼠的淋巴瘤细胞传代中，可与cmyc协同作用引起细胞转化和肿瘤形成〔1〕。有文献报道，Bmi1在多种肿瘤中高表达，尤以B细胞非何杰金淋巴瘤和非小细胞肺癌为甚〔2，3〕，被认为是一种癌基因。最近国外研究发现，Bmi1在胃肠道肿瘤细胞中过度表达，主要通过调节细胞周期在肿瘤发生发展中起重要作用〔4，5〕。然而，目前国内鲜见对Bmi1与结肠癌关系的报道。本研究通过检测Bmi1在结肠癌中的表达，观察其与结肠癌临床病理特征关系，以探讨Bmi1在结肠癌发生发展中的分子生物学特性。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　1.1.1 材料 收集我院2007年3～12月共63例行结肠癌根治手术切除的标本，留取癌组织及癌旁正常结肠组织。标本切取后迅速分成两份：一份用10%福尔马林固定,行病理学相关检查;另一份迅速放入液氮中冷冻并置-80℃冰箱中保存备用。所有标本均经病理学证实，要求癌组织中癌细胞≥60%。每例标本均有明确的病理诊断、病理分级、病历及完整的随访资料记录，临床分期均采用2003年国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(AJCC)联合制定的改良版DUKES分期法。所有患者术前未接受化疗和放疗，所有病例均取得病人家属的知情同意。

　　1.1.2 实验试剂及用品 总RNA分离试剂Trizol Reagent购自美国Gibco公司，RTPCR试剂盒(TaKaRa，大连宝生物工程有限公司)，Bmi1、GAPDH引物均由北京赛百盛公司合成。低温高速离心机购自德国Hettich公司，PCR扩增仪购自美国BIORAD公司，UV3200型紫外分光光度计为日本岛津公司产品，IBAS2.5全自动图像分析系统为德国Kontron公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 总RNA提取与定量 在液氮速冻条件下将标本组织磨成粉末，趁液氮尚未完全挥发时，把组织粉末转移到1.5 ml Eppendorf管中，每100 mg组织中加1.0 ml的Trizol裂解液，注射器吹打成匀浆状，氯仿异丙醇提取，最后用DEPC处理水溶解RNA。提取的总RNA经紫外分光光度计测定提取物浓度，A260/A280比值在1.8～2.0。胃癌组织、癌旁组织的总mRNA分别标记后，-20℃保存备用。

　　1.2.2 cDNA的合成 取2 μl总RNA在25 μl反应体系中逆转录成cDNA，该反应体系组成如下：10×RT缓冲液5 μl，oligo dT(18) 1 μl，dNTP 3 μl，RNAse Inhibitor 1 μl，MMLV逆转录酶1 μl，加入DEPC处理水至25 μl。70℃预变性5 min，42℃孵育60 min，冰上冷却后备用。

　　1.2.3 PCR反应 按试剂盒说明进行。反应体系：10×buffer 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，Taq DNA聚合酶0.5 μl，上、下游特异引物各1 μl，模板1.5 μl，DEPC处理ddH2O水补足25 μl，混匀，离心。Bmi1引物序列为：5′AGCAGAAATGCATCGAACAA3′和5′CCTAACCAGATGAAGTTGCTGA3′;以GAPDH作为内参照，引物序列为：5′CCATGGAGAAGGCTGGGG3′和5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。反应条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。每次扩增设置无模板cDNA的阴性对照,设置内参照管家基因GAPDH的阳性对照。

　　1.2.4 结果分析 取Bmi1和GAPDH扩增产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳(100 V，10 min)，经EB染色，用凝胶成像分析系统分析结果并拍照。

　　1.3 统计学处理 所得数据百分率比较采用χ2检验，所有统计均在SPSS10.0统计软件包中完成。

　　2 结 果

　　2.1 Bmi1 mRNA 表达特征 63例配对标本Bmi1 mRNA荧光检测比较，44例标本肿瘤组织中Bmi1基因mRNA表达明显高于癌旁正常组织(见图1)。

　　T：结肠癌组织;N：癌旁正常组织

　　图1 结肠癌及配对组织Bmi1基因的PCR产物

　　2.2 结肠癌组织Bmi1 mRNA差异表达与临床病理因素关系 结肠癌的各临床病理因素与Bmi1基因表达关系(见表1)，Crosstabs分析及ChiSquare Tests分析得出：Bmi1基因的表达与肿瘤体积大小、癌组织浸润深度密切相关，其阳性表达率分别为54.5%、86.7% (P<0.05);33.3%、81.3%(P<0.05);即肿瘤体积增大，Bmi1 mRNA阳性表达率也增高;随着癌组织浸润深度的增加，Bmi1基因在癌细胞内的含量逐渐增高。而Bmi1基因与患者性别、年龄、肿瘤的分化程度、部位无关(P>0.05)。表1 Bmi1表达与结肠癌临床病理因素之间的关系

　　3 讨 论

　　结肠癌的流行病学调查和病因学显示，其发病与生活方式、环境、结肠腺瘤等诸多因素综合作用有关，但分子作用机理尚不清楚。现较肯定与结肠癌发病有关癌基因主要有APC、MCC、Kras、p53等。Bmi1为较早发现的哺乳类动物PcG成员，其家族成员包括Bmi1、Mel18、BLG等一系列保守且重要的蛋白〔6〕。人类Bmi1基因定位于10号染色体短臂13区，其cDNA长3202 bp，开放的阅读框编码一个含326个氨基酸的蛋白质，该蛋白质含有一个位于N末端的环指结构域(ring finger domain，RF)和位于中心保守DNA结合模序螺旋转角螺旋转角(DNA banding helixturnhelixturn motif，HTHT)结构域〔7〕，正是这两个区域对细胞转化和肿瘤形成具有重要作用〔8〕。高表达Bmi1的细胞被认为是肿瘤中存在的“癌症干细胞”，对哺乳动物的骨骼、造血及神经发育发挥重要作用。Bmi1基因的发现为肿瘤的发病机制、临床病理联系及判断预后提供了一个新思路。

　　本实验采用RTPCR方法对63例结肠癌及其癌旁组织标本中Bmi1基因mRNA进行检测，旨在观察结肠癌组织中是否存在Bmi1基因表达，并就其与临床病理参数之间的关系进行研究。63例结肠癌中，Bmi1基因mRNA的阳性表达率为69.8%(44/63)，提示结肠癌组织中存在Bmi1基因高表达现象。本研究还显示，患者年龄大小、性别与结肠癌Bmi1基因mRNA表达的差异无统计学意义(P>0.05)。一般认为淋巴结转移与结肠癌预后关系密切，晚期结肠癌和/或出现淋巴结转移患者多病情凶险，预后不良。本实验结果表明，Bmi1基因在体积较大肿瘤中的表达明显高于体积小肿瘤;在伴有淋巴结转移的结肠癌中明显高于不伴淋巴结转移者;并随着肿瘤浸润深度的增加Bmi1基因mRNA阳性表达率逐渐增高，提示Bmi1基因可能在结肠癌的发展、浸润转移过程中起到重要作用。国外有研究〔7〕表明，Bmi1基因是一种转录抑制因子，一旦被激活可高表达于肿瘤细胞中，其核蛋白产物在INK4aARF位点，即多梳应答元件(polycomb response element，PREs)形成复合物介导相邻基因沉默，在转录水平来调控细胞的衰老和增殖，引起一系列的细胞生物学改变。INK4a编码p16INK4a，是细胞增殖周期中的一种周期素依赖性蛋白激酶抑制剂，能激活Rb的活性;ARF则编码p14ARF (小鼠中为p19ARF)，激活P53的活性，p16INK4a和p14/p19ARF作为Bmi1的下游调控位点，直接受Bmi1负调控。 Bmi1高表达的细胞通过抑制p16INK4a 和p14/p19ARF的表达延长细胞的增殖期，阻止细胞凋亡〔9〕。同时，Bmi1基因也可以通过诱导结肠癌细胞中端粒酶的活性促进其扩增，与肿瘤浸润转移密切相关〔10〕。此外，Bmi1基因作为cmyc癌基因的协同基因，在细胞的中心体扩增调节中起着重要作用，异常的中心体可以导致染色体的异常分裂，最终使遗传稳定性发生改变，干扰细胞正常活动而发生癌变。由此可见，Bmi1基因参与了结肠癌的发生发展过程，可作为临床监测病情的一个重要指标。

　　关于Bmi1基因的表达与肿瘤预后的关系，Song等〔10〕研究证实，在一组鼻咽癌患者中，Bmi1阳性者的五年生存率明显低于Bmi1阴性者，Bmi1阳性表达为独立的鼻咽癌预后因素，其表达上调是鼻咽癌患者预后不良的标志。本实验也发现，结肠癌Bmi1基因高表达可以增加淋巴结转移和组织浸润危险，从而也反映了恶性程度越高的结肠癌，其侵袭性强、浸润扩散严重，可能与Bmi1功能增强有关，即结肠癌组织中Bmi1基因过表达是判断预后的有效指标。

　　结肠癌发生发展是一个多阶段、多步骤、多因素参与的过程。随着医学的进一步发展，结肠癌的早期诊断率有了明显的提高，但在临床上不仅应注重早期诊断，还应关注是否有淋巴结转移及转移的严重程度，以便客观判断患者的预后。本研究提示Bmi1可能在结肠癌的浸润转移中起到重要作用，并有可能成为一个新的判断结肠癌预后分子标志物。

　　【参考文献】

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　　2 Vonlanthen S，Heighway J，Altermatt HJ,et al.The Bmi1 oncoprotein is differentially expressed in nonsmall cell lung cancer and correlates with INK4AARF locus expression〔J〕.Br J Cancer，2001;84:13726.

　　3 van Kemenade FJ，Raaphorst FM，Blokzijl T,et al.Coexpression of BMI1 and EZH2 polycombgroup proteins is associated with cycling cells and degree of malignancy in Bcell nonHodgkin lymphoma〔J〕.Blood，

　　4 Kim JH，Yoon SY，Kim CN,et al.The Bmi1 oncoprotein is overexpressed in human colorectal cancer and correlates with the reduced p16INK4a/p14ARF proteins〔J〕.Cancer Lett，2004;203(2):21724.

　　5 Reinisch C,Kandutsch S,Uthman A,et al.BMI1：a protein expressed in stem cells,specialized cells and tumors of the gastrointestinal tract〔J〕.Histol Histopathol,2006;21:11439.

　　6 龚 辉，张义成，刘文励.Bmi1基因调控造血干细胞自我更新的研究进展〔J〕.中国实验血液学杂，2006;14(2)：4135.

　　7 刘卫红，孟秀香，刘丹丹，等.反义Bmi1对Jurkat细胞的抑制作用〔J〕.中华血液学杂志,2005;26(9)：5546.

　　8 Gould A.Function analysis of mouse polycomb group and trithorax group related gene〔J〕.Curr Opin Genet Dev，1997;7(4):48894.

　　9 Itahana K，Zou Y，Itahana Y,et al.Control of the replicative life span of human fibroblasts by p16 and the polycomb protein Bmi1〔J〕.Mol Cell Biol，2003;23(1):389401.

　　10 Song LB，Zeng MS，Liao WT,et al.Bmi1 is a novel molecular marker of nasopharyngeal carcinoma progression and immortalizes primary human nasopharyngeal epithelial cells〔J〕.Cancer Res，2006;66(12):622532.