散发性大肠癌hMLH1和APEX基因多个单核苷酸多态性的检测及意义
发表时间：2010-07-01 浏览次数：419次
作者：李静 陈丽 肖琳 安鼎伟 李迎杰 作者单位：辽宁医学院附属第一医院消化科，辽宁 锦州 121000
【摘要】目的 探讨hMLH1 T1151A和APEX A1247G，APEX T2197G多个单核苷酸多态性与散发性大肠癌的关系。方法 选取散发性大肠癌患者100例，并以100例正常人为对照。基因组DNA分别由大肠癌患者的癌组织中及健康人的外周血白细胞中提取，采用单链构象多态性分析结合基因序列分析，检测hMLH1 T1151A和APEX A1247G、APEX T2197G的多态性。结果 hMLH1 T1151A的多态性在正常人中发生率1.0%，在散发性大肠癌组中发生率11.0%，差异有显著性(χ2=4.48，P<0.05);APEX A1247G的多态性在正常人中发生率1.0%，在散发性大肠癌组中发生率13.0%，差异有显著性(χ2=4.84，P<0.05);APEX T2197G的多态性在正常人中发生率3.0%，在散发性大肠癌组中发生率27.0%，差异有显著性(χ2=9.44，P<0.01)。关联性分析显示hMLH1 T1151A和APEXA1247G无相关性，和APEXT2197G存在相关性;APEXA1247G和APEXT2197G存在相关性。结论 hMLH1 T1151A和APEX A1247G、APEX T2197G的多个单核苷酸多态性可能与散发性大肠癌的发生有关，可作为散发性大肠癌的筛查和预后监测指标。
【关键词】 大肠癌;单核苷酸多态性;APEX;hMLH1
大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，也是众多肿瘤中遗传因素最突出的一种肿瘤。研究表明，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，尤其是位于蛋白编码区的SNP和位于表达调控序列的SNP在功能和致病方面具有重要意义〔1〕。DNA修复能力的个体差异可能是决定肿瘤遗传易感性的极为重要的因素，一些DNA修复基因所具有的SNP可能导致氨基酸的改变从而影响其DNA修复活性〔2〕。hMLH1基因是错配修复基因，是细胞内修复系统的重要组成基因，它的突变导致基因功能的丧失是遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)发病的主要原因之一〔3〕。脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶(APEX)是碱基切除修复过程中的限速酶，参与DNA损伤修复，与氧化还原有关，与凋亡相关〔4〕。本实验应用单链构向多态性分析(single strand conformation polymorphism，SSCP)及DNA测序法，对辽西地区散发性大肠癌患者hMLH1 和APEX基因的多个SNP进行联合检测，以探讨hMLH1 和APEX基因的多个SNP与大肠癌之间的关联，为大肠癌的筛查和预后监测提供指标。
1 材料与方法
1.1 病例资料
大肠癌患者均为2006年1月至2008年12月辽宁医学院附属第一医院普外科住院病例，男45例，女55例，年龄22～78岁，平均年龄(56.42±10.35)岁，家族中无大肠癌病人。术前均未经放化疗，术后病理证实为大肠癌。每个病例均取新鲜癌组织，-80℃保存，提取DNA待用。同时取100名健康志愿者的静脉血5 ml，提取DNA作对照。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂
DNA提取试剂盒，DNA回收纯化试剂盒，Taq聚合酶等均购自上海Gentime公司，常规试剂由本院实验中心提供。引物由上海生工公司合成，DNA测序由大连宝生物公司完成。
1.2.2 基因组DNA 提取
采用DNA提取试剂盒提取癌组织和静脉血的基因组DNA。严格按说明书操作。DNA提取后用紫外分光光度计检测DNA 含量，A260/A280为1.65～2.0。DNA置-20℃冰箱保存。
1.2.3 PCR引物设计及反应条件
根据参考文献〔2〕设计3对引物,引物序列及扩增长度见表1。PCR反应体系25 μl，Mix 12.5 μl，双蒸水8.5 μl，引物各1 μl，模板2 μl。反应条件：hMLH1：94℃预变性5 min;94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min;72℃ 10 min;APEX：94℃预变性5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min;72℃ 10 min。表1 PCR扩增引物序列及扩增长度(略)
1.2.4 SSCP
取5 μl PCR产物加5 μl变性缓冲液，95℃变性10 min，后置于冰上10 min，将此混合物全部上样，行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：电泳缓冲液1×TBE，电压120 V，电泳8 h。电泳结束后凝胶用0.2%硝酸银染色并干燥保存。有异常泳动条带者为阳性病例。
1.2.5 DNA测序
将SSCP测定有异常泳动条带病例的肿瘤组织和正常组织PCR产物进行直接DNA测序。
1.3 统计学方法
应用SPSS12.0软件行相关数据分析，采用R×C表χ2检验及四格表χ2检测。APEX、hMLH1的相关性比较采用2×2配对资料的关联性分析。
2 结 果
2.1 hMLH1的SNP的检测
大肠癌组中11例hMLH1的1151位碱基发生杂合型突变T→A，基因频率hMLH1 T1151A (11/200)，其中杂合子TA10例，纯合子AA1例。正常对照组中1例hMLH1的1151位碱基发生杂合型突变T→A，基因频率hMLH1 T1151A(1/200)。两组相比差异有显著性 (χ2=4.48，P<0.05)。
2.2 APEX的SNP的检测
大肠癌组中13例APEX的1247位点存在A →G的多态性，基因频率APEX A1247G(13/200)，12 例为杂合子(AG);1例为纯合子(GG);100例正常对照组中2例APEX的1247位碱基发生杂合型突变T→A，基因频率APEX A1247G(2/200)，两组相比，差异有显著性(χ2=4.84，P<0.05)。100大肠癌组中27例APEX的2197位点存在TG 的多态性，纯合子GG 3例，杂合子GT 24例，基因频率APEX T2197G(27/200);100例正常对照组中3例APEX的2197位碱基发生杂合型突变T→G，基因频率APEX T2197G(3/200)，两组相比差异有显著性(χ2=9.44，P<0.05)。
2.3 大肠癌组hMLH1和APEX的SNP的相关性分析
大肠癌组hMLH1 T1151A和APEX A1247G经2×2配对资料的关联性分析，χ2=0.05，P=0.824，提示无相关性;大肠癌组hMLH1 T1151A和APEX T2197G经2×2配对资料的关联性分析，χ2=6.25，P=0.011，列联系数r=0.243，提示存在相关性;大肠癌组APEX A1247G和APEX T2197G经2×2配对资料的关联性分析,χ2=4.971，P=0.024，列联系数r=0.218，提示存在相关性。
3 讨 论
SNP是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生置换、颠换、缺失和插入等变化，而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。通常认为SNP只有两种类型，即双等位基因。基因组中的SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性。因此,寻找不同疾病相关的SNP对疾病的预测、诊断和治疗意义重大。
散发性大肠癌的发病率高，发病原因复杂，虽然无明显家族史，但其分子生物学特征、临床病理表现及预后与遗传性非息肉性大肠癌有许多相似之处。
错配修复(mismatch repair，MMR)基因是纠正碱基错配的主要因子，目前已发现人类的MMR系统含有9个错配修复基因，其中以hMLH1和hMSH2功能最为重要。hMLH1和hMSH2的突变是造成某些散发性结肠癌发生的主要原因。不过在散发性结肠肿瘤hMLH1表达缺失率高于hMSH2。hMLH1基因定位于3p21，cDNA全长2 484 bp，编码由756个氨基酸残基组成的蛋白。近年研究已发现在大肠癌患者中存在hMLH1基因的多个SNP位点。有报道部分HNPCC患者中hMLH1基因在第4l位密码子有一个CT突变，使相应的氨基酸残基由丝氨酸变成苯丙氨酸，还有人检测到第578至632位密码子之间的杂合性缺失及从第727位密码子的第一个核苷酸开始的4个核苷酸的缺失，在另外一些病例的第519位密码子则存在一个T的插入，造成hMLH1蛋白产物的羧基端238个氨基酸残基的缺失〔5〕。Song等〔6〕报道在115例结直肠癌患者中hMLH1 A655G 占11.3%，在正常对照人群中的发生率仅3.0% ，提示hMLH1 A655G 可能在结直肠癌的癌变中发挥重要作用。国内范凯等〔7〕研究显示50例结肠癌标本有3例hMLH1基因第12号外显子检出突变，突变位点均是第1151位碱基发生杂合型突变T→A，认为散发性大肠癌hMLH1基因第384位密码子的错义突变可能增加罹患大肠癌的危险性。但该研究缺乏正常人群对照。张晓梅等〔8〕在结直肠癌患者的体细胞中发现了位于hMLH1基因第ll5l位碱基TA的杂合型颠换，导致其第384位编码氨基酸由缬氨酸(Va1)突变为天冬氨酸(Asp)。 本研究结果显示散发性大肠癌hMLH1基因的1151位碱基发生杂合型突变T→A，基因频率hMLH1 T1151A(11/200)，与正常对照组基因频率hMLH1 T1151A(1/200)相比差异有显著性。此与上述结果基本一致，提示hMLH1 T1151A 可作为散发性大肠癌的常规检测位点，对散发性大肠癌的筛选和诊断有重要意义。
APEX基因是碱基切除修复的重要成员,主要负责修复烷化剂和氧化损伤造成的脱嘌呤/脱嘧啶位点。定位于14 号染色体长臂(14q111.212)，是已知的人类基因组中最短的序列之一,从转录起始位点到多聚腺苷酸尾部约长216 kb,编码由318个氨基酸组成的蛋白。APEX基因是一种多功能蛋白，由氧化还原功能区和DNA修复功能区构成，其中氧化还原功能可以调节体内众多转录因子的DNA 结合活性,从而与细胞增殖、转化及细胞凋亡相关。APEX的1247位碱基位于氧化还原功能区，当1247A→G 转换可导致第64位氨基酸由异亮氨酸( Ile) 变为缬氨酸(Val)，产生I64V变异体，可能引起分子构象改变而直接影响其氧化还原活性。Hadi 等〔9〕通过直接测序方法检测了128 例具有种族代表性的美国正常人群该基因所有外显子中的多态性,发现642V的频率为2/256 。汤显斌等〔10〕研究显示150例散发性大肠癌患者中17例发生1247A→G的多态性，认为APEX A1247G多态性在中国人散发性大肠癌中的频率远高于国外报道正常人群中的频率,可作为遗传流行病学研究的候选位点。本研究显示散发性大肠癌组中APEX的A1247G多态性基因频率(13/200)，与正常对照组中基因频率APEX A1247G(2/200)相比差异有显著性;与上述研究结果相近。大肠癌中APEX的2197位点是另一个较常发生变化的位点，通常存在TG的多态性。本研究的检测结果为散发性大肠癌基因频率APEX T2197G(27/200)与正常对照组中基因频率APEX T2197G(3/200)相比差异有显著性，提示APEX的A1247G和T2197G可作为散发性大肠癌的常规检测位点。
笔者同时对散发性大肠癌组hMLH1 T1151A和APEX的SNP进行了关联性分析，结果显示hMLH1 T1151A和APEX A1247G无相关性，和APEX T2197G存在相关性;APEX A1247G和APEX T2197G存在相关性。提示在散发性大肠癌的发生过程中存在多基因和多位点的变异。但由于本研究的病例数有限，尚需大样本研究有待进一步确立基因间的相关性。
突变检测和病因学研究，对大肠癌的预防、诊断和治疗有着重要的理论意义和实践价值。通过对其发病的基因水平研究，阐明发病的机制，可提高大肠癌的早期诊断率，并可预见部分患有大肠癌的直系亲属发癌的可能性，对这些家系进行必要的医学监护，以早期发现大肠癌，也可以通过一定的干预措施预防大肠癌的发生。
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9 Hadi MZ，Coleman MA，Fidelis K,et al.Functional characterization of ape1 variants identified in the human population〔J〕.Nucleic Acid Res,2000;28(20):38719.
10 汤显斌,谭云山,侯 君,等.中国人散发性大肠癌APEX 基因氧化还原功能区中常见的单核苷酸多态性〔J〕.肿瘤防治杂志,2003;10(10):10125.
