生长抑素受体亚型mRNA在大肠癌中的表达
发表时间：2010-08-17 浏览次数：425次
作者：李敏 张弘，潘 骅， 黄介飞， 魏 群 作者单位：(1南通大学医学院，南通226001;2南通大学附属医院消化病研究室)
【摘要】 目的： 探讨大肠癌组织中生长抑素受体(SSTR)各亚型基因的表达以及与临床病理参数的关系。方法：采用RT-PCR法检测了41例大肠癌患者癌组织和癌旁组织中生长抑素受体亚型 mRNA的表达。结果：41例大肠癌患者的癌组织和癌旁组织中SSTR1 mRNA表达的阳性率分别为82.93%(34/41)和68.29%(28/41);SSTR2 mRNA表达的阳性率分别为92.68%(38/41)和90.24%(37/41);SSTR3 mRNA表达的阳性率分别为43.90%(18/41)和36.59%(15/41);SSTR4 mRNA表达的阳性率分别为60.98%(25/41)和39.02%(16/41)，而SSTR5基因在大肠癌及癌旁组织表达缺失。结论：大肠癌组织中大多数有一种以上生长抑素受体亚型基因的表达，其中SSTR2为主要表达亚型;各亚型间可能存在有协同作用的关系。
【关键词】 大肠癌;生长抑素;受体;信使核糖核酸
Expression of somatostatin receptor subtypes mRNA in colorectal carcinoma
LI Min1，ZHANG Hong2,PAN Hua2，et al (1Medical College，Nantong University，Nantong 226001;2Laboratory of Digestive Disease, Affiliated Hospital of Nantong University)
[Abstract] Objective: To investigate expressions of SSR subtypes mRNA in tissue of colorectal carcinoma. Methods: The expressions of SSTR subtypes mRNA in the tumor tissues of colorectal carcinoma and the adjacent tissues of cancer in 41 patients with colorectal carcinoma were examined by RT-PCR. Results: The positive rates of expressions of SSTR1 mRNA were 82.93%(34/41)in the tissues of colorectal carcinoma and 68.29%(28/41)in the adjacent tissues of cancers respectively. The positive rates of expressions of SSTR2 mRNA were 92.68%(38/41) and 90.24%(37/41) in the tissue of colorectal carcinoma and its adjacent tissue of cancer, respectively. The positive rates of expressions of SSTR3 mRNA were 43.90%(18/41) and 36.59%(15/41)respectively. The positive rates of expressions of SSTR4 mRNA were 60.98%(25/41) and 39.02%(16/41)respectively. Conclusion: There is more than one SSTR subtype genes expression in tumor tissues of colorectal carcinoma, and SSTR2 is the main subtype for expression in tissues of colorectal carcinoma.
[Key words] Colorectal carcinoma;Somatostatin;Receptor;mRNA
结直肠癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一，目前在我国结直肠癌发病率位于所有恶性肿瘤的3~4位，其死亡率居恶性肿瘤死亡的第4位。生长抑素(somatostatin，SST)及其类似物(somatostatin analogue，SSTA)可抑制肿瘤的增殖，对大肠癌的抑制作用也有相关报道[1-2]。SST和SSTA对肿瘤的抑制主要是通过其受体发挥作用，为了了解大肠癌组织中SSTR受体的表达情况，本研究采用RT-PCR的方法检测和分析了人大肠癌组织、癌旁组织中SSTR亚型mRNA的表达情况，并初步探讨SSTR亚型的表达与大肠癌的发生、发展的关系。
1 材料与方法
1.1 组织标本 收集2007年4月~2007年9月期间南通大学附属医院住院治疗并经手术切除大肠癌41例患者的肿瘤组织及癌旁组织，其中男18例，女23例，年龄26~85岁，平均 58岁,所有组织均行病理学检查确诊;大肠癌高/高中分化组15例，中分化组19例，低/低中分化组7例;有淋巴结转移的10例，无转移的31例;直肠癌15例，左半结肠癌13例，右半结肠癌13例;临床DUKE分期：A1+A2期4例，A3期26例，C1+C2期11例。
1.2 RT-PCR法
1.2.1 引物设计与合成 从GeneBank查取基因序列，以Primer5软件设计SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5各亚型及β-actin的引物各1对，其序列分别为：
扩增片段大小分别为362 bp、100 bp、292 bp、233 bp、198 bp和485 bp。上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。
1.2.2 RT-PCR扩增 用TRIZOL试剂从组织中抽提总RNA，严格按说明书操作。按普通RT-PCR方法进行进行逆转录。PCR扩增按94 ℃预变性60 s，94 ℃变性 45 s,55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，40个循环后，再72 ℃延伸5 min进行。扩增结束后产物在1.6%琼脂糖凝胶中，以120 V电泳约30 min。在320 nm紫外透射仪下与DNA标准带进行比较，判断SSTR 各亚型mRNA的扩增结果，检测吸光度值，将各型SSTR吸光度值与β-actin吸光度值的比值作为其mRNA水平的相对值。
1.3 统计学方法 用Stata7.0统计软件包处理、分析数据，样本率之间的比较采用χ2检验或Fisher’s确切概率法;并应用Swilk检验检测数据资料是否正态分布，配对设计的比较采用配对t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 SSTR 5种亚型mRNA在大肠癌组织中的表达 41例大肠癌患者的癌组织中SSTR1 mRNA、SSTR2 mRNA、SSTR3 mRNA、SSTR4 mRNA、SSTR5 mRNA基因表达阳性率分别为82.93%(34/41)、92.68%(38/41)、 43.90%(18/41)、 60.98%(25/41)、0%(0/41)。41例大肠癌患者的癌旁组织中SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4和SSTR5 mRNA各亚型基因表达阳性率分别为68.29%(28/41)、90.24%(37/41)、36.59%(15/41)、39.02%(16/41)、0%(0/41)。SSTR5基因在大肠癌及癌旁组织表达缺失(图1)。
2.2 SSTR各种亚型mRNA在大肠癌组织中相对表达量 见表1，图2。SSTR2 mRNA亚型在癌组织中就性别、分化程度、有无淋巴结的转移部位和临床分期的比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 SSTR各亚型RNA在大肠癌和癌旁组织中组合表达 41例大肠癌患者的癌组中14例(34.15%)有4种亚型基因表达;有3种亚型基因表达13例(31.71%);有2种亚型基因表达10例(24.39%)，只有1种亚型基因表达4例(9.76%)(图3)。
3 讨 论
SST及其SSTA生物活性的发挥是通过靶细胞膜上特异性受体介导的。目前发现人生长抑素受体属于G蛋白偶联型受体，由7个跨膜α-螺旋结构、细胞外N-末端和细胞内C-末端片段及连接这些结构的细胞外环和细胞内环构成。不同的受体亚型发挥不同的介导作用，根据它们对配基亲和力的不同分为两大类，一类为SSTR1和SSTR4，另一类为SSTR2、SSTR3和SSTR5。
SSTR在SST抗肿瘤机制中的作用尚未明了，目前认为SSTA与SSTR结合后通过以下途径发挥抗肿瘤作用：(1)通过与腺苷酸环化酶负性结合;(2)增加细胞内总蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)活性，特别是酪氨酸磷酸酶SHP-1(PTP1C);(3)通过抑制ERK1/2信号传导和小G蛋白Ras激活而发挥作用;(4)抑制细胞外Ca2+内流，影响Na+/H+交换及磷酸酶C和磷酸酶A2的活性;(5)抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)提高P21和P22的表达[3-4]。
实验证明RT-PCR是检测SSTR基因在组织及细胞中表达情况可靠和特异的手段[5]。本实验采用RT-PCR方法检测41例大肠癌组织中发现38例(92.68%)SSTR2 mRNA基因表达为阳性。在5种亚型中表达率最高。同时本实验的结果显示在大肠癌组织中至少有一种受体亚型基因的表达，其中只有一种亚型基因表达为9.76%。因此SSTR2 mRNA基因在大肠癌组织中的高表达及大肠癌组织中多种亚型的表达对于临床选用生长抑素类似物治疗胃癌有重要意义。但SSTR5 mRNA基因的表达缺失，这可能与SSTR的表达特点有关，在不同的种属、不同的部位表达的亚型，表达的量不同。我们在前期有关肝癌组织、癌旁组织及正常非肝癌组织中SSTR各亚型mRNA的表达的研究中也发现[6]，SSTR5 mRNA在这些组织中的表达是缺失的，而其他4种亚型均有不同的表达。同是在本实验过程中运用相同的引物检测胃癌及癌旁组织中却有SSTR5 mRNA表达(待发表)。故我们认为在人大肠癌和大肠组织中SSTR5 mRNA基因可能表达缺失，这可能是由于不同部位而导致的不同表达结果。提示我们在临床上对大肠癌的诊断和治疗时，应采用与SSTR2高亲性和高特异性的SST和SSTA而不用仅与SSTR5结合的SST和SSTA。
RT-PCR结果经半定量分析显示，在SSTR1、SSTR2、SSTR3和SSTR4 mRNA亚型基因在大肠癌中表达的量各不相同，其中SSTR1、SSTR3和SSTR4 mRNA亚型基因的表达量与癌旁组织表达量相比较差异有统计学意义，可能与肿瘤组织中丰富的血管分布有关，SST与肿瘤血管内皮细胞上的SSTR结合后，一方面可通过抑制血管内皮细胞氮氧化物合成酶(eNOS)与MAPK活化的级联反应，或间接抑制IGF-I、VEGF等生长因子的分泌及减弱单核细胞的趋化性，从而抗肿瘤血管生成，抑制肿瘤生长及移植瘤的生成[7]。这在结直肠肿瘤中尤为突出，其受体亚型可能是SSTR2，这提示SST和SSTR很可能在肿瘤与宿主间血流动力学的相互作用中扮演了重要的调节角色，对肿瘤基质产生、肿瘤血管形成及肿瘤的血管引流产生影响，同时还可产生缩血管效应，使肿瘤血供发生障碍，抑制肿瘤的生长。Denzler等[8]以125I-[Tyr3]标记的奥曲肽应用放射自显影法检测215原发肿瘤及25例转移瘤周围血管SSTR表达情况，结果发现肿瘤周围血管有SSTR的分布，且越靠近肿瘤血管SSTR的密度越高。各亚型基因的表达在性别、部位、分化程度、有无淋巴结转移和临床分期上差异无统计学意义。本实验结果显示可将人工合成的SSTA与SSTR特异结合的特点，运用在利用放射标记的SSTA来定位胃癌的核素成像技术和SSTA为目标的化疗或与细胞毒性的药物结合的临床抗肿瘤的治疗。
动物及临床实验均已证实生长抑素类似物对大肠癌患者肿瘤的缩小、改善症状、提高生活质量、延长生存期方面有着较肯定的作用。但SSTR并非表达于全部大肠癌组织中，使SSTA治疗肿瘤存在不足，且SSTR各亚型抗肿瘤的机制不同。5种亚型可能有精确的解决信号转导通路的行为，SSTR5较SSTR2和SSTR1更倾向于具有内在化调节的作用，SSTR2和SSTR3是介导生长抑素释放，抑制内皮细胞增殖和诱导细胞凋亡，故了解各受体亚型的抗肿瘤机制，同时选择特异的抗肿瘤亚型对于抗肿瘤治疗具有重要意义。
【参考文献】
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