肝癌中基质金属蛋白酶及其抑制因子的研究进展

　　作者：程桂丹1，陆枫林2 作者单位：(1. 东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009; 2.东南大学附属中大医院 消化科，江苏 南京 210009)

　　【摘要】 基质金属蛋白酶(MMP)家族是降解细胞外基质的重要酶类，组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)是MMP的天然抑制物。在细胞外基质中MMPs和TIMPs的失衡已证实与多种病理状态,尤其是与肿瘤的侵袭和转移密切相关。作者就MMP和TIMP的结构、功能及其与肝癌(HCC)侵袭、转移的研究进展进行综述。

　　【关键词】 基质金属蛋白酶; 基质金属蛋白酶组织抑制因子; 肝癌; 综述

　　Research progress in matrix metalloproteinases and their inhibitors

　　of heatocellular carcinoma

　　CHENG Guidan1, LU Fenglin2(1. Department of Clinical Medicine, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Gastroenterotogy,

　　Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] The matrix metalloproteinase(MMP) family is an important enzyme degrading extracellular matrix, and the tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP) is a natural inhibitor of MMP. The imbalance of MMPs and TIMPs in the extracellular matrix has confirmed to relate with a variety of pathological states, especially tumor invasions and metastasis. Here, a review concerning about the research proceeding of the structures and functions of MMPs and TIMPs, the relationship between them and hepatocellular carcinoma(HCC) invasion or metastasis is presented.

　　[Key words] matrix metalloproteinase; the tissue inhibitor of metalloproteinase; hepatocellular carcinoma; review

　　肿瘤的侵袭与转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，是一个多步骤的复杂过程。目前研究表明，肿瘤的侵袭和转移都需要借助于蛋白酶的表达与激活[1]。基质金属蛋白酶(MMPs)是人体内降解细胞外基质(ECM)的主要酶类，参与肿瘤演变的众多生理和病理过程。MMPs的活性受内源性组织抑制因子(TIMPs)调节。TIMPs通过与MMPs结合形成复合体，有效终止MMP家族成员的水解活性。对MMPs的深入研究，将有助于对恶性肿瘤侵袭、转移机制的进一步认识，从而为肿瘤转移治疗提供方向。作者就肝癌中MMPs及TIMPs的研究进展进行简要综述。

　　1 MMPs

　　1.1 MMPs的结构

　　MMPs是一类具有Zn2+依赖性的内源性蛋白水解酶,几乎能降解除多糖外ECM的所有成分。自1962年Gross等人首先发现第一种间质胶原酶并命名为MMP1，至今在MMP家族中至少已发现26个成员[2]。所有成员至少有以下6个共同点：(1) 均含有Zn2+中心;(2) 通常在中性条件下发挥活性，有Ca2+参与时活性最大;(3) 其结构具有高度的恒定性;(4) 均以酶原形式分泌;(5) 均能水解至少一种ECM成分;(6) 其活性均可被TIMPs所抑制，每种MMP至少被一种TIMPs抑制[3]。

　　1.2 MMPs的分类

　　MMPs具有高度的同源性，按作用底物不同主要可将其大致分为以下几类：(1) 胶原酶，包括MMP1、8、13，主要降解Ⅰ和Ⅲ型胶原;(2) 基质酶(间质溶素)，包括MMP3、10、11，主要降解Ⅲ、Ⅳ型胶原和基质中的蛋白多糖、糖蛋白;(3) 明胶酶，包括明胶酶A(MMP2)和明胶酶B(MMP9)，主要降解Ⅳ型胶原纤维和层粘连蛋白;(4) 膜类基质金属蛋白酶(MTMMP)，包括MMP14、15、16、17、24、25，这种酶表达于细胞表面，除能降解ECM外，对MMP2和MMP13有激活作用;(5) 弹性蛋白酶(MMP12);(6) 其它,包括MMP19、20、23、26。

　　1.3 MMPs的调控

　　正常生理条件下，MMPs的活性很低并受控于3个因素：(1) 基因转录;(2) MMPs前肽(酶原)的激活;(3) TIMPs的调节。MMPs的生物合成由其基因转录率所决定。而MMPs的基因转录受许多因素的影响,如MMP9的1562位存在C到T的突变时可影响MMP9基因的表达水平[4]。其中，生长因子和细胞因子等活性介质是酶原合成阶段最主要的调节因素，它们不仅能促进或抑制MMPs mRNA的转录，而且能影响其半衰期;另外，一些黏附分子(受体)、TPA等致癌剂以及细胞外环境等因素均对MMPs的转录有调控作用。MMPs的活性抑制可发生在两个层次上：一是在前肽转化为活性形态时;二是其活体与TIMPs结合而被抑制。MMPs与TIMPs的平衡程度决定了净MMPs活性，同时也是决定ECM转化的重要因素，其在组织重建、血管生成、伤口愈合、胚胎发育、肿瘤细胞的侵袭转移等过程中发挥重要作用[5]。

　　1.4 MMPs在肿瘤发生和转移中的作用

　　MMPs对肿瘤的影响机制可能有：(1) 破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障。MMPs可以通过分解ECM成分使其降解成小的孔隙，破坏ECM的完整性，从而使肿瘤细胞可以通过这些孔隙扩散而促进肿瘤的侵袭转移[6]。(2) 促进新生血管形成。肿瘤细胞除自身分泌MMPs外，还通过分泌促血管生成因子，间接促进血管内皮细胞产生MMPs，降解基底膜(BM)和ECM成分，进而促进肿瘤新生血管的生成。MMPs在血管形成的基底膜降解、细胞运动和管腔形成等过程中起重要作用，还可提高促血管生成因子如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子2β(TGF2β)及转化生长因子2α(TGF2α)的作用。Fang等[7]研究证实在肿瘤结节内新生血管形成的早期，MMP2有重要的作用。MMP2外源性抑制物或反义核酸均能导致肿瘤蛋白水解能力及血管新生能力的丧失。有报道表明MMP7可剂量依赖性地加速体外内皮细胞增生，并促进内皮细胞分泌MMP1和MMP2来溶解血管周围的基底膜和(或)连接组织[8]。(3) 调节细胞黏附。肿瘤细胞要成功地完成移动过程，必须具有黏附和脱黏附的能力。Deryugina等[9]研究证实，膜型基质金属蛋白酶1(MT1MMP)能活化整合素ανβ，进而增强玻璃粘连蛋白介导的乳腺癌MCF7细胞株的黏附与移行，同时共表达MT1MMP。与整合素ανβ结合的MCF7细胞株能最有效地与MMP2的C末端结合并活化MMP2，进一步证实MMPs与TIMPs在肿瘤转移过程中具有调节细胞黏附的重要作用。(4) 激活具有潜在活性的蛋白质。研究表明，MMPs能激活两类具有潜在活性的蛋白质，即血浆纤维蛋白原和层粘连蛋白5。Folkman等[10]分离得到了一种具有很强的抗血管增生活性的蛋白质——血管抑制素(angiostatin)，这种蛋白质为由原位增殖性肿瘤分泌的具有抑制肿瘤转移和生长能力的因子。测序表明，血管抑制素是无蛋白水解活性的血浆纤维蛋白原的一个片段。随后证实，MMP3、7、9、12都可使血浆纤维蛋白原降解为血管抑制素的类似片段。

　　2 TIMPs

　　2.1 TIMPs的一般生物学特性

　　TIMPs是一组很早就被发现的糖蛋白，广泛分布于组织和体液中，可由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等产生。TIMPs是组织中MMPs主要的内源性抑制因子，能特异地抑制MMPs家族的基质降解酶。TIMPs与MMPs的亲和力不同，但皆以可逆的非共价的形式按1∶1的比例结合到MMPs的活性位点。己发现的TIMPs有4种，分别命名为TIMP1、2、3、4。在肝脏中只发现TIMP1和TIMP2的表达。TIMPs的结构具有一定的同源性,有两个功能区:氨基末端功能区相对保守,为与MMPs Zn2+活性中心结合的区域;羧基末端功能区，在TIMPs定位和(或)与前酶型MMPs形成复合物方面有重要意义。

　　2.2 TIMPs的分布及功能

　　TIMP1(相对分子质量28 000)在体内分布最广，能被多种细胞因子诱导产生，可与所有MMPs结合，尤其是MMP1、2、3、7、9;TIMP2(相对分子质量21 000)多随MMP2的表达而表达，很少受细胞因子的诱导，可与MMP1、2、3呈1∶1结合;TIMP3(相对分子质量24 000)最初是从SV240转化的鸡胚纤维细胞中分离出来的，仅存在于ECM中。TIMP4(相对分子质量22 600)在ECM的组织特异性调节循环中起着很重要的作用。TIMPs是多功能分子，不仅抑制MMPs的活性，且具有细胞生长因子样作用，促进成纤维细胞(成肌纤维细胞)增生及胶原合成，使ECM沉积并抑制其降解[11]。TIMPs可调控ECM代谢和抑制血管的生成，还可抑制肿瘤细胞的发生、侵袭和转移。TIMP1和TIMP2能刺激多种细胞增殖并且抑制活化的肝星状细胞(HSC)凋亡。TIMPs调节肿瘤细胞与基质的相互作用，在肝癌侵袭过程中扮演十分重要的角色，TIMP1可能是肝癌肺转移的标志[6]，TIMP2与肝癌预后显著相关[12-13]。

　　3 MMPs/TIMPs与肝癌

　　3.1 在肝癌中的表达

　　对MMPs/TIMPs在肝癌中的表达情况仍有争议。有报道称，在肝细胞癌中MMPs表达为阴性，而TIMPs在肝细胞癌(HCC)中表达同样明显减少甚至为阴性[14]。但谢玉梅等[15]研究发现,正常肝组织和肝转移的高分化腺癌组织中无TIMP1、2表达,而HCC无论是癌组织还是癌旁组织二者均有表达,阳性信号分布在胞浆内,且TIMP1的表达强于TIMP2。Lichtinghagen等[16]报道，正常肝细胞中有MMP1、2、3、9、11的表达，但未检测到MMP7。HCC中MMPs表达类型与正常肝区别不大，但在表达量上存在不同，MMP3、MMP10、MMP2、MMP9、MMP1表达增强，MMP11无改变。此外，Sakamoto等[17]报道小肝癌细胞MMP9出现过量表达，但蔡阳等[18]研究发现HCC组织中MMP9表达与肿瘤大小、病理分化无关，正常肝、HCC及癌旁组织均有MMP9 mRNA表达，而在19.1% HCC病例癌旁组织MMP9 mRNA的表达与癌组织相等或反而增高。另有报道成纤维细胞中高表达的MMP1与肝癌的恶性预后有关[13]。

　　3.2 参与肝癌的侵袭、转移

　　肿瘤侵袭转移必须首先去除基底膜的机械屏障，MMPs在此过程中起重要作用[1]。胡劲松等[19]研究发现肝癌细胞中高表达MMP9，低表达TIMP2，这可能是肝癌细胞侵袭、转移的主要基础。而MMP2并无重要作用，与肝癌预后关系不密切。Kuyvenhoven等[20]用ELISA法检测了91例肝病患者血浆MMP2和MMP9水平,与正常对照相比,MMP2含量在慢性肝病和肝癌中明显升高,并随ChildPugh分级增加而增高。由于慢性肝病和肝癌患者血浆MMP2的水平相似,故认为不能将其作为诊断标志物。但刘玮等[21]研究显示MMP2在HCC组织中表达上调，且与肿瘤大小、分化程度、静脉浸润、TNM分期相关，提示MMP2阳性表达者预后不良。近期，陈连周等[22]发现MMP9在HCC癌组织和癌旁组织中的表达阳性率高于正常肝组织，但TIMP2在HCC癌组织中表达阳性率低于癌旁组织和正常肝组织，而且TIMP2表达随癌的转移而降低。而Altadill等[13]新近研究表明基质细胞中高表达的TIMP2与肝癌侵袭转移相关，这可能因为TIMPs是多功能蛋白质，除可抑制MMPs外，还可以直接促进肿瘤转移[23]。

　　3.3 在肝癌治疗中的临床意义

　　在肝癌的治疗中，手术切除被认为是首选的方法。肝癌的病死率很高，术后转移和复发是影响患者术后长期生存的首要原因。对MMPs的研究有助于了解肝癌的侵袭转移机制。Mckenna等[24]研究了MMPs及TIMPs在肝癌输出淋巴结中的表达情况，发现除淋巴细胞持续高表达的TIMP1无明显变化外，MMP2、7、9及TIMP2 mRNA在HCC输出淋巴结中的表达量均显著增加。而且MMPs与TIMPs的增加比率不同，这可能与微小转移瘤自身在输出淋巴结中的表达及肿瘤、周边基质细胞和多种细胞因子刺激MMPs的表达有关。输出淋巴结在肿瘤侵袭转移中起重要作用，因此可用输出淋巴结中MMPs和TIMPs mRNA的表达情况反映肿瘤的整体特征。Cheng等[25]在探索加强放射促进HCC侵袭的分子机制时发现，加强放射治疗可使MMP9 mRNA、蛋白水平及活性上调，而MMP9反义核苷酸可抑制这种上调进而阻止加强放射治疗导致的HCC侵袭。随后进一步研究发现加强放射治疗可通过PI3K/Akt/NFкB信号转导通路，而不是AP1通路增加MMP9的活性从而加速HCC的侵袭。毕明俊等[26]观察原发性肝癌患者射频消融术(RFA)治疗前后血浆MMPs(MMP1、7、9、13)的浓度改变，发现HCC患者血浆MMP1、9、13的浓度明显高于正常值范围，RFA治疗后其浓度暂时性升高，然后下降至较低水平。因此，MMP1、9、13可作为肝癌患者诊断和RFA疗效判断指标。Zhang等[27]发现结合TNM分期，MMP2、MMP9可以很好地预测HCC患者肝移植后的预后[27]。

　　3.4 在肝癌治疗中的临床应用

　　以上大量研究表明,MMPs和TIMPs在肝癌中起重要作用。而MMPs和TIMPs的作用是复杂的平衡体系,在疾病状态下会发生改变,可能成为新的治疗靶标。在各种癌症模型中给予合成的TIMPs,通过细胞凋亡或血管生成抑制机制,减少原发性肿瘤生长及癌转移,这些已有临床前研究数据证实。目前人们研究的抗肿瘤侵袭和转移的治疗方法主要有以下几个方面：(1) MMPs抑制因子的应用,包括巴马司他、普马司他、马马司他和美他司他等。初步结果表明,它们不仅能抑制ECM降解,还显示出抑制新生血管形成的作用[28]。(2) 反义核苷酸及RNA干扰技术，RNA干扰技术是近年来发展起来的研究基因功能的新工具。Lakka等[29]实验证明,利用反义核酸技术可以降低MMP9的表达,减少肿瘤细胞的侵袭力。利用反义技术及RNA干扰可以改变和抑制肿瘤生物学行为,是肿瘤治疗的新方向。(3) 基因治疗，在动物模型体内进行TIMPs的转基因治疗发现其具有抗肿瘤的作用[30],肿瘤基因治疗是一种新的方法。

　　4 展 望

　　研究MMPs与TIMPs在肝癌中的诊断价值，对于判断预后及治疗具有重要的意义。在肿瘤的发生发展过程中，MMPs的表达均增高，其过度表达与淋巴结转移及预后不良有关[31]，可以通过对肿瘤及癌旁组织中的MMPs/TIMPs的测量来判断患者的预后。在肿瘤的治疗方面，人工合成的TIMPs已进入临床试验阶段，有关资料显示，该类生物制剂是非细胞毒性的，能明显抑制体内肿瘤的生长、浸润和转移，从而有效地预防肿瘤的复发。与细胞毒性药物的联合使用能明显提高患者生存率。因此，自20世纪90年代以来，MMPs及TIMPs一直是肿瘤研究领域的一个热点。研究MMPs/TIMPs及其与各种细胞因子之间的相互作用，必将在分子基因水平上有进一步的认识，指导我们的临床工作，也为抗肿瘤转移治疗提供了一个重要靶点。但仍存在以下问题：(1) MMPs家族各个成员的结构以及功能有待进一步了解;(2) HCC不同发展阶段各型MMPs表达情况的相关研究不多;(3) MMPs与TIMPs相互作用的调控机制不甚明了;(4) 特异性强、毒副作用低的TIMPs有待进一步研发。深入研究MMPs和TIMPs的作用不仅有助于对肝癌侵袭转移的认识，同时也为肝癌的治疗提供了一个极有希望的发展方向。

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