RANTES、MIP1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制研究

RANTES、MIP1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制研究作者：王晓颖 樊嘉 周俭 邱双健 吴晓峰 刘银坤 汤钊猷　    作者单位：200032 上海，复旦大学中山医院肝外科、肝癌研究所    【摘要】  目的 探讨RANTES、MIP1α趋化因子促人肝癌细胞侵袭运动的机制。方法 使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察RANTES、MIP1α刺激后人肝癌细胞聚合型肌动蛋白(Factin)聚合的变化。采用明胶酶谱法分析RANTES、MIP1α对人肝癌细胞基质金属蛋白酶分泌及活性的影响。结果 RANTES、MIP1α可诱导人肝癌细胞内Factin的聚合，并刺激细胞突起和伪足形成。明胶酶谱显示RANTES、MIP1α刺激后人肝癌细胞基质金属蛋白酶MMP2、MMP9等活性显著增加，降解基质能力增强。结论 RANTES、MIP1α趋化因子可以诱导Factin聚合促进人肝癌细胞定向运动，并通过增加基质金属蛋白酶活性提高人肝癌细胞侵袭能力。     【关键词】  肝肿瘤； 趋化因子； 细胞运动； 肿瘤浸润     Mechanism of RANTES and MIP1α promoting invasion and migration of hepatoma carcinoma cellsWANG Xiaoying, FAN Jia, ZHOU Jian, QIU Shuangjian, WU Xiaofeng, LIU Yinkun, TANG Zhaoyou. Department of Liver Surgery, Zhongshan Hospital, Liver Cancer Institute, Fudan University, Shanghai 200032, China  Corresponding author: FAN Jia, Email: jiafan99@yahoo.com    【Abstract】  Objective  To investigate mechanism of chemokines including RANTES and MIP1α promoting invasion and migration of hepatoma carcinoma cells (HCC). Methods  The polymerization of HCC Factin stimulated by RANTES and MIP1α was evaluated by flow cytometry and confocal microscope. Gelatin zymography assay was used to observe effect of RANTES and MIP1α on secretion and activity of matrix metalloproteinase of HCC.Results  Both RANTES and MIP1α could prominently promote polymerization of Factin and formation of cell process and pseudopodia of HCC. Gelatin zymography assays showed that the activities and degeneration potential of MMP2 and MMP9 in HCC were increased following stimulation with RANTES and MIP1α. Conclusions  Both RANTES and MIP1α can promote migration of HCC by inducing polymerization of Factin and increase invasive potential of HCC by enhancing activity of MMPs.    【Key words】  Hepatoma carcinoma;  Chemokines;  Cell migration;  Tumor invasion    趋化因子(chemokines)是一类分泌型小分子蛋白质。近来发现其与肿瘤侵袭转移密切相关［1-2］。我们前期研究发现肝癌细胞表达CCR1趋化因子受体，其配体RANTES、MIP1α等趋化因子可以促进肝癌细胞侵袭运动［3］。为进一步阐明RANTES、MIP1α等趋化因子促进肝癌细胞侵袭运动的机制，本研究深入观察RANTES、MIP1α刺激后人肝癌细胞聚合型肌动蛋白(Factin)及基质金属蛋白酶变化情况。1  材料与方法    1.1  细胞培养    高转移人肝癌细胞株MHCC97H由本所建立。采用DMEM培养液，37 ℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养。    1.2  悬浮细胞肌动蛋白聚合试验    将处于对数生长期的MHCC97H人肝癌细胞常规消化脱壁， 重悬于PBS， 浓度为1×106个细胞/ml。取上述细胞悬液分别加入含100 ng/ml的RANTES或MIP1α(R&D公司)无血清DMEM培养液，不加趋化因子为空白对照。分别于趋化因子刺激后15、30、60、120、300和600 s时，加入固定染色液［含0.1 mg/ml LPC，磷酸缓冲液配制的10%福尔马林，1.65×10-6 mol/L的FITCPhalloidin(Molecular Probes公司)］并染色10 min。染色后的细胞1 500 r/min离心5 min，用1 ml PBS液重悬细胞，上流式细胞仪分析。每次分析1×105个细胞。最大激发波长为560 nm，吸收波长为540 nm。以空白对照组的荧光总量为100%计算趋化因子刺激各时间点荧光总量的相对比值。    1.3  贴壁细胞的肌动蛋白聚合试验    将处于对数生长期的MHCC97H人肝癌细胞常规消化脱壁，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，制备浓度为1×104个细胞/ml。将上述细胞悬液加入预置细胞培养载玻片的6孔培养板的各室中，培养24 h至肿瘤细胞完全贴壁，PBS液洗涤。每室加入含100 ng/ml RANTES或MIP1α的无血清高糖DMEM培养液2 ml，不加趋化因子为对照，孵育2 h。吸弃培养液，用PBS液洗涤。加入3.7%中性甲醛固定10 min，PBS液洗涤。丙酮脱水1 min。每孔加入1 ml PBS液配制的0.2% Triton X100，室温处理10 min透化细胞，PBS液洗涤。每张爬片孔分别滴加100 μl 10 μg/ml FITCPhalloidin，避光室温孵育40 min。PBS洗涤除去未结合的FITCPhalloidin。每孔加入200 μl PBS液1∶1 000稀释的DAPI(Molecular Probes公司)，复染核0.5 min。流水缓慢冲洗2 min，除去未结合的DAPI。吸去多余水分，空气中阴干后，VECTASHIELD抗褪色封片剂(Vector公司)封片，用激光扫描共聚焦显微镜观察。    1.4  明胶酶谱法测定金属蛋白酶活性    5×105个细胞接种于6孔培养板，加含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养24 h，至60%～70%。移去培养液，加入含100 ng/ml趋化因子的无血清培养液，对照不加趋化因子，孵育24 h。吸取上清液，离心去除细胞。BCA法测定总蛋白，调整溶液体积使蛋白浓度为2.0 mg/ml。配制含0.1%明胶和0.1% SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶，取条件培养液10 μl与等体积的2×上样缓冲液(0.125 mol/L TrisHCL，pH 6.8，20%甘油，4% SDS，0.005%溴酚蓝)混合，于Tris甘氨酸SDS电泳缓冲液中电泳，电压为12 V/cm3，直至溴酚蓝跑至凝胶底部；置于复性缓冲液(25% Triton X100)中轻摇，室温孵育30 min×2次； 置入显影缓冲液(含0.121% TrisBase、0.63% TrisHCL、 1.17% NaCl、 0.074% CaCl2、0.002% Brij35)，摇床缓慢摇动，37 ℃孵育18 h；0.5%的考马斯亮蓝R250染色30 min；加入脱色液(含50%甲醇、10%乙酸)适当脱色；凝胶用成像分析系统行灰度扫描及图像分析，以电泳条带的光密度值代表酶活性进行定量分析。    1.5  统计学分析    应用SPSS 11.5统计软件进行分析，计量资料采用±s表示，两样本均数的比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  RANTES、MIP1α对人肝癌细胞肌动蛋白聚合的影响    RANTES刺激悬浮MHCC97H人肝癌细胞后，可显著增加MHCC97H细胞Factin的聚合，30 s时Factin的含量即可达到高峰，为基础含量的2.1倍，但此后Factin含量又逐渐下降，至300 s后基本维持在一个比较恒定的水平。而MIP1α刺激后， 60 s时Factin的含量达到高峰，为基础含量的1.8倍。RANTES、 MIP1α刺激MHCC97H细胞后，不同时间点Factin含量变化见图1。    共聚焦显微镜观察贴壁生长的MHCC97H细胞，对照组在没有RANTES或MIP1α刺激的状态下，肿瘤细胞呈多边形，细胞内Factin含量较少，呈丝状排列，细胞突起少见。在加入RANTES或MIP1α刺激60 min后，部分细胞形态发生明显变化，产生较多突起和片状、丝状伪足，细胞内Factin的含量显著增加，并在细胞伪足和细胞运动的前导侧浓集，见图2。    2.2  RANTES、MIP1α对人肝癌细胞降解细胞外基质能力的影响    明胶酶谱显示MHCC97H细胞体外培养可分泌MMP2、MMP9及活性型MMP9等基质金属蛋白酶，但以MMP2为主。受100 ng/ml RANTES或MIP1α刺激后，MHCC97H细胞分泌基质金属蛋白酶活性增加(图3)。对明胶酶谱条带IOD值的分析显示：RANTES或MIP1α处理后细胞中MMP2、MMP9及活性型MMP9的分泌均显著上调(P<0.05，表1)。表1  趋化因子对人肝癌细胞基质金属蛋白酶分泌及活性的影响(IOD值)3  讨论    趋化因子是一类细胞因子样的具有趋化作用的分泌型小分子蛋白质 (相对分子质量为8 000～10 000)，根据其氨基端半胱氨酸残基的数量及空间排列不同分为C、CC、CXC和CX3C 4类。趋化因子受体属G蛋白耦联的7次跨膜受体超家族，其N末端与配体结合，胞内区与G蛋白耦联，C末端含丝氨酸/苏氨酸，可磷酸化，参与信号转导。趋化因子通过与靶细胞膜上相应的趋化因子受体结合发挥作用。趋化因子在调节白细胞定向移动、淋巴细胞归巢、免疫应答和血管生成等众多生理、病理过程中起着非常重要的作用。越来越多的证据表明， 趋化因子与肿瘤的侵袭、转移密切相关［1-2］。但趋化因子及受体在肝癌侵袭转移中作用研究甚少。Kubo等［4］报道肝癌IL8表达水平与肝癌血管侵犯相关。Yang等［5］发现CCL3与肝癌进展有关。我们前期研究发现RANTES、MIP1α等趋化因子可以促进人肝癌细胞侵袭运动，但机制尚未阐明。    以肌动蛋白为基础的运动系统是细胞对外界刺激产生反应的重要动力结构。肌动蛋白丝是目前公认的肿瘤细胞运动及转移相关骨架蛋白。细胞在接受细胞外信号刺激后，游离型的肌动蛋白形成聚合型的肌动蛋白，而后者在细胞执行多种生物学功能中发挥重要的作用，如伪足形成、趋化反应、胞吞胞吐作用、细胞质分裂、细胞增殖、组织形成等［6-8］。本研究中应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测发现，受RANTES、MIP1α等趋化因子刺激后，人肝癌细胞中Factin的含量迅速增加，在60 s内即可达到峰值，随后Factin可向细胞膜下或细胞运动的前导侧聚集。在贴壁细胞中还可观察到突起和伪足形成。由于伪足在细胞定向运动中具有重要作用。因此RANTES、MIP1α等趋化因子可以通过CCR1受体引起人肝癌细胞内Factin的聚合和伪足的形成，诱导肝癌细胞定向迁移运动。    肿瘤细胞在侵袭转移过程中会遇到一系列组织屏障。这些屏障由细胞外基质中的基底膜及间质、基质所组成，肿瘤细胞侵袭转移时必须释放各种蛋白水解酶降解基质成分并突破这些屏障，其中基质金属蛋白酶类与肿瘤侵袭转移联系最为广泛［9］。我们前期体外侵袭试验证实RANTES、MIP1α等趋化因子可增加人肝癌细胞侵袭穿透人工重建基底膜胶(Metrigel胶)的能力。本研究采用明胶酶谱分析显示肝癌细胞接受RANTES、MIP1α等趋化因子信号刺激后，MMP2、MMP9等金属蛋白酶活性上调。Theret等［10］报道MMP2与肝癌转移能力呈正相关。Chung等［11］证实MMP9表达及活性上调可以增加肝癌侵袭性。RANTES、MIP1α等趋化因子上调人肝癌细胞多种基质金属蛋白酶表达水平及活性，提示其可以通过增强肝癌细胞降解细胞外基质的能力促进肝癌细胞侵袭性。    综上所述，RANTES、MIP1α等趋化因子可以诱导Factin聚合和伪足形成，促进人肝癌细胞定向运动，并通过上调MMP2、MMP9基质金属蛋白酶活性增加人肝癌细胞侵袭性。由于RANTES、MIP1α等趋化因子在体内多种病理生理条件下广泛表达，因此两者可能在肝癌侵袭转移中起重要作用，阻断RANTES、MIP1α等趋化因子与肝癌细胞相互作用、抑制其信号传导通路可抑制人肝癌细胞侵袭运动，为防治肝癌转移复发提供新策略。【参考文献】［1］ Balkwill F. 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