全胃切除术后家兔营养不良的实验研究

全胃切除术后家兔营养不良的实验研究作者：任重 牛伟新 刘寒 何国栋 王洪山 高晓东    作者单位：200240 复旦大学附属上海第五人民医院普外科(任重)； 200032 上海，复旦大学附属中山医院普外科(牛伟新、刘寒、何国栋、王洪山、高晓东)    【摘要】  目的 通过建立家兔全胃切除和迷走神经干切断的模型，初步探讨全胃切除术后所引起的进食减少、体质量下降、营养不良的原因。方法 新西兰兔24只，随机分为A组(对照组)、B组(全胃切除组)和C组(迷走神经干切断组)，观察B、C组手术后体质量比、进食量、血浆胆囊收缩素、胃动素含量、近段小肠上皮单糖转运体GLUT5和SGLT1的mRNA表达情况等指标，并和A组比较。结果 与A组相比，B组术后体质量比、进食量明显下降。家兔术后血浆胃动素含量变化不大，胆囊收缩素含量分别于术后第3天和第14天升高(P<0.05)。B组家兔十二指肠和空肠GLUT5 mRNA表达显著下降(P<0.05和<0.01)。在十二指肠和空肠B组家兔SGLT1 mRNA表达均无变化(P>0.05)。C组家兔术后上述指标与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 全胃切除术后与胃动素相关的消化间期小肠蠕动和食物排空速度可能未出现改变，而胆囊收缩素含量上升可能与中枢性摄食抑制﹑食欲下降有关；胃切除后家兔小肠近段GLUT5 mRNA表达明显下降，SGLT1 mRNA表达无变化。迷走神经干的切断在这些病理生理变化中不起重要作用。    【关键词】  全胃切除术； 迷走神经干切断术； 营养不良； 家兔     Malnutrition following total gastrectomy in rabbits  REN Zhong*, NIU Weixin, LIU Han, HE Guodong, WANG Hongshan, GAO Xiaodong.*Department of Gengeral Surgery, Fifth Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China   Corresponding author: NIU Weixin, Email: wxniu@zshospital.com   【Abstract】  Objective  To explore preliminarily the causes for anorexia, weight reduction  and malnutrition after total gastrectomy by establishing rabbit model of total gastrectomy and vagotomy. Methods  Twentyfour New Zealand rabbits were divided randomly into group A (control group), group B (undergone total gastrectomy) and group C (undergone vagotomy ) . The ratio of the weight, the amount of food taken, the content of cholecystokinin (CCK) and motlin in plasma, the expression of the mRNA of GLUT5 and SGLT1 at the epithelium of the proximal part of small intestine in groups B and C after operation were observed and compared with those in group A. Results  Compared with group A, the ratio of the weight and the amount of food taken in group B were reduced more distinctly. The content of motlin in group B showed little change, while the content of CCK was elevated at days 3 and 14 after operations (P<0.05). The expression of GLUT5 mRNA at duodenum and jejunum decreased notably in group B compared with group A (P<0.05 and P<0.01 respectively). But the expression of GLUT5 mRNA at duodenum and jejunum showed no statistical deference in group B compared with group A (P>0.05). In group C, all these indices had no statistical deference compared with group A (P>0.05). Conclusions  After total gastrectomy, the peristalsis of small intestine and the evacuation of the food in interdigestive period correlated with motlin may not change, while the increase of the content of CCK may cause central feeding inhibition and anorexia. After total gastrectomy, the expression of GLUT5 mRNA at the proximal part of small intestine of the rabbits is decreased but that of SGLT1 mRNA remains unchanged. Vagotomy shows no contribution to all these pathophysiologic changes.   【Key words】  Total gastrectomy;  Vagotomy;  Malnutrition;  Rabbits    全胃切除术是治疗胃癌的重要术式之一。但由于其手术范围广，创伤较大，术后不可避免地会发生一些病理生理上的改变。全胃切除同时也伴随着迷走神经干的切断，手术以后所出现的种种病理生理方面的改变是由于机体失去胃引起的还是迷走神经干切断引起的，也没有明确答案。    本实验通过家兔全胃切除和迷走神经干切断模型的建立，观察术后体质量、血浆胆囊收缩素、胃动素含量、近段小肠上皮单糖转运体：Na+依赖性单糖转运体1(sodium dependent glucose transporter 1，SGLT1)和易化性单糖转运体5(facilitated glucose transporter 5，GLUT5)的mRNA表达情况等指标的变化，初步探讨全胃切除术后营养状况低下的原因。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  动物：成年新西兰兔24只，雌雄不限，体质量2.2～3.2 kg，由复旦大学附属中山医院动物实验室代购。    1.1.2  仪器：立式压力蒸汽灭菌器(LSB50L型)购自上海华线医用核子仪器有限公司；低温高速离心机(Labofuge 400R型)购自德国Heraeus Instruments公司；电热恒温水浴锅(H.H.S型)购自上海医疗器械五厂；RNA/DNA Calculator仪(Gene Quant Ⅱ型)购自Pharmacia Biotech公司；PCR仪(PTC150型)购自美国MJ Research，INC.公司；电泳仪购自(DYA型)上海生化所巴斯生物技术开发公司；测量用电泳条带灰度软件(Alpha ImagerTM 2000 Documentation & Analysis System，Alphamager 3.21软件)购自AlphaInnotech Corporation公司。    1.1.3  试剂：SK1361试剂盒、DEPC液、Oligo(dT)15、10 mmol/L 4 dNTP混合液、RevertAidTM MMuLV反转录酶、正义及反义引物、Taq PCR催化酶、GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder、琼脂糖凝胶，均购自生工生物工程(上海)有限公司。溴化乙锭由复旦大学附属中山医院中心实验室惠赠。    1.2  动物模型的建立    家兔分为3组，每组8只。A组为假手术组(对照组)，B组为全胃切除组，C组为迷走神经干切断组。氯胺酮1 mg/kg肌肉注射麻醉。    A组家兔打开腹腔后用生理盐水纱布覆盖内脏，1 h后关闭腹腔。B组家兔行全胃切除(切除范围从贲门至幽门近侧约0.5 cm处)，然后将食管拉下与近段十二指肠行端侧吻合。C组家兔进腹后钝性分离食管下段周围结缔组织，包括筋膜，神经，血管，予切断，结扎。使食管下段贲门周围完全游离，食管肌层光滑，不见任何结缔组织、神经组织。手术后均肌肉注射庆大霉素针4万U。    3组家兔术前均禁食12 h(不禁水)，B组家兔术后第1、2天静脉输液。A、C组术后不必输液。3组家兔均于术后第2天饮5%葡萄糖生理盐水，第3～5天喂食青菜叶，第6天过渡到正常兔饲料饮食。    1.3  体质量的测定及体质量比的定义    3组家兔分别于手术日(术前)﹑术后第5、10、15、20、25、30天上午8点喂食前测量体质量。B组家兔手术后即刻测量切下的胃质量，术后测得体质量加上胃质量即为当日体质量数据。因3组家兔术前可能存在着体质量上的不均衡(为提高手术存活率，B组家兔一般采用较健壮，体质量偏重的家兔)，故采用体质量比作为计算指标，即每只家兔体质量以手术日(术前)为基准，计算当日体质量测量数值与手术日(术前)体质量测量数值的比值，定义为体质量比。    1.4  进食量的测定    3组家兔分别于术后第10、15、20、25、30天测定24 h的进食量(计算当天上午8时至第2天上午8时的进食量)。    1.5  血浆胃动素﹑胆囊收缩素含量的测定    3组家兔分别于术后第1、3、7、14天上午8点从耳缘动脉采血3.5～4 ml。采血前禁食(不禁水)12 h。然后制成血浆。用放免法测定血浆胃动素和胆囊收缩素的含量(由第二军医大学神经生物学教研室代测)。    1.6  近段小肠上皮GLUT5和SGLT1 mRNA的检测    1.6.1  黏膜标本的采集：3组家兔小肠黏膜标本均在术后第30天采集。采集时间为16：00-17：00。采集前禁食24 h(不禁水)。家兔麻醉后切开腹腔，分别距离幽门10 cm和100 cm向远侧取下约10 cm的肠段，作为十二指肠段和空肠段。将取下的肠段沿对系膜缘纵向剪开，放入无菌冰生理盐水震荡漂洗3次，最大限度的清洗掉黏附在黏膜上皮的小肠内容物，包括食物残渣、黏液、杂质。用经过消毒、1∶1 000 DEPC液脱酶后的玻璃片将黏膜组织刮下。RTPCR方法检测小肠黏膜SGLT1和GLUT5 mRNA的表达。PCR过程中所有离心管﹑移液管都要经过灭菌。    1.6.2  PCR扩增步骤：94 ℃变性5 min，然后进行30个循环， 每个循环包括94 ℃变性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。扩增结束后PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶(加入溴化乙锭5 μl/100 ml)中电泳。所获条带用灰度测量软件进行灰度分析，测定目的基因产物灰度和内参照(βactin)基因产物灰度的比率(PCR率)，半定量测定目的基因的表达。见表1。    1.7  统计学分析    3组数据均数差别检验采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。2  结果    2.1  术后3组家兔体质量变化、进食量变化、血浆胃动素和胆囊收缩素的值(表2～5)表1  引物序列及其在基因组中的位置    核酸序列位置产物大小SGLT1：Sence5′TCATGATGGTGGGCTCTGTG3′652～671Antisence5′GCACGACGCAGGCAACTTTG3′1 065～1 046414 bpGLUT5：Sence5’TGACGGAGTTCTACAACGAC3′161～180Antisence5′CAAGTACATAGGGACCACGT3′474～455313 bpβactin：Sence5′CCTGTACGCCTCTGGCCGTACCACT3′2 088～2 112Antisence5′CTGTAGCCGCGCTCGGTGAGGATCT3′2 261～2 237174 bp 表2  3组家兔体质量比变化表3  3组家兔术后进食量对比表4  3组家兔血浆胃动素含量对比(单位：pg/ml)表5  3组家兔血浆胆囊收缩素含量对比    2.2  十二指肠、空肠上皮GLUT5和SGLT1 mRNA的表达    十二指肠上皮GLUT5 mRNA的表达，B组比A组显著减弱(P<0.05)；SGLT1 mRNA的表达与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、2和表6。空肠上皮GLUT5 mRNA的表达，B组比A组显著减弱(P<0.01)；SGLT1 mRNA与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、4和表6。十二指肠上皮GLUT5 mRNA、SGLT1 mRNA的表达与空肠上皮比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、6和表6。表6  3组家兔十二指肠﹑空肠上皮GLUT5 mRNA 和SGLT1 mRNA的PCR值表达3  讨论    全胃切除术对机体的功能恢复和生活质量均产生较大影响。其中最明显的就是食欲下降、体质量减轻、营养不良，缺少饥饿感，90%的患者诉有早期饱胀感［1］，60%～70%的患者术后体质量过轻，平均比术前减轻25%［2］。其具体机制目前尚未阐明。    3.1  动物模型建立以及3组家兔体质量比的变化    全胃切除模型的建立曾采用过多种动物，包括狗、猪、大鼠、猴等。由于狗、猪、猴实验成本较高，大鼠体积较小、无法反复采血进行相关检测，而家兔体积适中、性情温顺、依从性相对较强、实验成本较低，故本实验采用家兔制作全胃切除模型。    在制模过程中注意以下问题。理论上家兔的胆总管开口于十二指肠起始处。但我们却发现有部分家兔的肝十二指肠韧带直接与胃窦部相连，如果行彻底的全胃切除将不可避免地导致胆总管误结扎和损伤，术后动物出现重度阻塞性黄疸而于短期内死亡。所以我们在切除胃时远端切线设置在幽门近侧约0.5 cm处，以保护肝十二指肠韧带，避免胆总管受到损伤，然后用碘伏纱布擦拭残余胃窦部黏膜，破坏黏膜细胞，尽量消除残余胃窦黏膜对术后观察指标的影响。做吻合时避免将远端食管与残胃吻合，这样可导致术后较高的吻合口漏发生率。我们先将残余胃窦部用丝线关闭(用30丝线缝合一层即可)，然后在十二指肠起始处对系膜缘剪开一长约0.3 cm的小口，将食管拉下与小口行端侧吻合，用30丝线行单层缝合即可，事实证明可基本杜绝吻合口漏的发生，同时也可将残余胃窦黏膜旷置，进一步减少其对观察指标的影响。    本实验显示行全胃切除后家兔进食量与对照组相比明显减少(P<0.01)，体质量下降，进行性消瘦。术后第10天B组家兔体质量比开始低于A组家兔(P<0.05)。此后，B组家兔体质量比呈进行性下降，至术后第15天后，B组家兔体质量比远远低于A组家兔(P<0.01)。而C组家兔术后第10天进食量有所减少(P<0.05)，但在第15天后，进食量逐渐恢复，与对照组相当(P>0.05),在整个实验过程中体质量比与A组比较均无差异(P>0.05)。说明迷走神经干的切断在全胃切除术后所出现的进食减少、体质量下降、营养不良等病理生理变化中不起主要作用。    3.2  手术后胃肠激素的变化    胃肠激素在机体进食、营养物质的吸收中起重要作用，最受关注的是胃动素和胆囊收缩素(CCK)。CCK被认为是一种“饱感因子”，是机体内重要的“饱中枢信号”［3］。本实验显示，行全胃切除及迷走神经干切断后血浆胃动素含量与A组家兔相比未发生明显变化，说明全胃切除后胃动素所引发的消化间期小肠蠕动和食物排空速度未发生改变，全胃切除后食糜通过小肠的速度可能因此未发生变化，其与家兔术后的营养状况恶化关系并不大。    兔类胃的容积占消化道总体容积的1/3左右。术后第1天家兔还处于禁食阶段，无食物摄入，故血浆中CCK含量变化不大。进食后由于失去了胃的缓冲作用，摄入的食物直接进入十二指肠，引起肠道碳水化合物浓度突然升高，机械性牵张作用急剧加大，促使I细胞大量分泌，可能是引起术后第3天CCK分泌增加的原因。当B组家兔由菜叶过渡到正常饲料饮食时还无法适应，进食很少，可能是术后第7天血浆CCK含量有所下降的原因。另一原因也可能和样本量不足有关。到了术后第14天B组家兔逐渐适应了正常兔饲料饮食，进食有所恢复，体内CCK含量再次出现升高。这也说明全胃切除后家兔体内CCK含量总体趋势是增高的。    C组家兔手术创伤较小，消化道结构未发生明显改变，影响CCK分泌变化的因素相对较小，可能是术后血浆CCK含量无明显改变的原因。    本实验说明全胃切除后家兔血浆中CCK含量总体趋势是升高的。全胃切除术后血浆胆囊收缩素的升高在随后所出现的食欲低下﹑营养不良等现象中可能起了重要作用。但手术后观察时间较短(仅3 d至2周)，有待于进一步研究。    3.3  手术后近段小肠上皮单糖转运体的变化    碳水化合物主要在小肠吸收，大多数在小肠上皮被分解为单糖，经相应的单糖转运体被吸收入体内。小肠上皮细胞主要有两种吸收单糖的转运体：SGLT1和GLUT5。SGLT1特异性转运D葡萄糖和D半乳糖，与钠离子协同转运，转运过程是耗能的。小肠上皮黏膜对单糖的吸收与SGLT1表达明显相关［4］。GLUT5特异性转运D果糖，通过易化作用将底物顺浓度差转运入上皮细胞，其转运过程不耗能。位于小肠上皮细胞基底膜的GLUT2转运体随后将吸收入小肠上皮细胞的D葡萄糖、D半乳糖、D果糖转运出小肠上皮细胞，进入血液循环。    B组家兔术后1个月小肠近段上皮细胞GLUT5 mRNA表达明显减少，可能导致肠道碳水化合物吸收的下降。SGLT1 mRNA表达未出现明显变化。但我们并不能由此认为由SGLT1所介导的单糖吸收功能正常。本实验只是对SGLT1 mRNA的表达灰度进行了半定量的测定，没有对SGLT1蛋白及蛋白翻译以后的修饰调控进行相关检测，还有待于进一步研究。    Tavakkolizadeh等［5］通过对小鼠的研究，发现SGLT1和GLUT5基因表达的通路与迷走神经无关。本实验中C组家兔在行迷走神经切断术后与对照组相比小肠GLUT5与SGLT1 mRNA的表达无明显差异，说明在全胃切除术后GLUT5 mRNA表达的下降与迷走神经的切断无关，可能另有原因。    全胃切除术后机体营养不良的机理非常复杂。本实验认为全胃切除术后胆囊收缩素的升高可能导致动物中枢性厌食。而手术以后营养状况恶化似乎与消化间期小肠蠕动以及食糜通过小肠的速度无关，和迷走神经干的切断也无关。手术以后小肠上皮GLUT5 mRNA表达的下降也与迷走神经的切断无关，可能另有原因，有待于进一步探讨。【参考文献】  ［1］ Bradley E L 3rd, Isaacs J T, Hersh T, et al. Nutritional consequences of total gastrectomy. Ann Surg,1975,182(4):415-429.  ［2］ Zittel T T, Glatzle J, Muller M, et al. Total gastrectomy severely alters the central regulation of food intake in rats. Ann Surg,2002,236(2):166-176.  ［3］ 舒鼎铭，覃健萍，曹永长，等.胆囊收缩素(CCK)的生物学功能研究进展.饲料工业,2004,25(11)：12-16.  ［4］ Loo D D, Zeuthen T, Chandy G, et al. Cotransporter of water by the Na+glucose cotransporter. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(23):13367-13370.  ［5］ Tavakkolizadeh A, Ramsanahie A, Levitsky L L, et al. Differential role of the vagus in diurnal gene expression rhythms in the small intestine. J Surg Res,2005,129(1):73-78.