冷保存对大鼠部分移植肝再生的影响
发表时间：2010-01-11 浏览次数：597次
冷保存对大鼠部分移植肝再生的影响作者：袁晟光 王继见 董家鸿 作者单位：400038 重庆,第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院 【摘要】 目的 探讨冷保存对大鼠部分肝移植术后肝再生的影响。方法 健康SD大鼠分为Ⅰ组(肝切除组)、Ⅱ组(冷保存1 h部分肝移植组)和Ⅲ组(冷保存8 h部分肝移植组)。观察各实验组生存率，比较各组术后1、6、12、24、48、72、168 h肝质量/体质量比率、肝再生率、有丝分裂指数及增殖细胞核抗原表达。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组7 d存活率分别为100%、90%、40%；Ⅲ组术后2～3 d大鼠肝质量/体质量比率、肝再生率、有丝分裂指数较Ⅰ、Ⅱ组明显偏低(P<0.05)；Ⅲ组术后12 h内增殖细胞核抗原表达较其余两组明显偏低(P<0.05)，48 h才达高峰，至第7天阳性表达仍处高水平。结论 长时间冷保存降低了部分肝移植术后的肝再生能力和大鼠术后生存率。 【关键词】 部分肝移植； 肝再生； 冷保存； 大鼠 Effect of cold preservation on liver regeneration after partial liver transplantation in rats YUAN Shengguang, WANG Jijian, DONG Jiahong. Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China Corresponding author: DONG Jiahong, Email: dongjh301@163.com 【Abstract】 Objective To evaluate the effect of different duration of cold preservation on survival rate and liver regeneration after partial liver transplantation in rats. Methods All SD rats were divided into liver resection group (Group Ⅰ), partial liver transplantation plus 1 hour cold preservation group (Group Ⅱ) and partial liver transplantation plus 8 hours cold preservation group (Group Ⅲ). The 7day survival rate was observed. The liver/body weight ratio, liver regeneration rate, hepatocyte mitotic index and the expression of the proliferative cell nuclear antigen (PCNA) were compared among three groups at hour 1, 6, 12, 24, 48, 72 and 168 after operation. Results The 7day survival rate in Groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ was 100%, 90% and 40%, respectively. The liver/body weight ratio, liver regeneration rate and hepatocyte mitotic index in Group Ⅲ were significantly lower than those in Groups Ⅰ and Ⅱ at postoperative days 2 and 3 (P<0.05). Compared with Groups Ⅰ and Ⅱ, the PCNA expression in Group Ⅲ was significantly lower within 12 hours after operation (P<0.05), reached peak at hour 48 and remained at a high level at day 7. Conclusion Long period of cold preservation significantly impairs the regeneative ability of the liver and survival rate of rats after partial liver transplantation. 【Key words】 Partial liver transplantation; Liver regeneration; Cold preservation; Rats 供肝短缺已成为影响肝移植发展的主要原因。部分肝移植作为解决这一问题的重要手段近年来得以广泛开展。供肝在移植过程中将不可避免地遭受冷保存损伤［1］，而部分肝移植的供肝还额外遭受了大块组织的丧失，它必须通过快速再生来确保其正常功能及受者存活。然而，冷保存对移植肝再生有何影响仍知之甚少。本实验对此进行了初步研究。1 材料与方法 1.1 动物及分组 雄性SD大鼠，质量190～300 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。实验分3组：Ⅰ组为肝部分切除组，Ⅱ组为冷保存1 h部分肝移植组，Ⅲ组为冷保存8 h后行部分肝移植组。于术后1、6、12、24、48、72、168 h处死动物(每个时相点4只大鼠)，收集标本待检。 1.2 模型建立 1.2.1 部分肝移植： 动物术前禁食12 h， 不禁水， 清洁手术， 乙醚持续吸入麻醉。参照文献［2］的方法建立无肝动脉血供、 二袖套法大鼠肝脏移植模型。术后肌注150 mg/kg氨苄青霉素， 自由进食饮水。 1.2.2 部分肝切除：乙醚麻醉，腹部正中线切口入腹，游离肝脏后将左叶及尾状叶结扎切除。术后处理同部分肝移植。 1.3 观察指标及其检验方法 1.3.1 肝质量/体质量比率及肝再生率：肝质量/体质量比率为大鼠处死时肝脏湿质量与大鼠体质量百分比。肝再生率(%)=［C-(A-B)］/(A-B)×100%， 其中A为供肝减体积前肝质量或肝切除组大鼠理论肝质量，B为切除肝质量，C为最后取下的再生肝质量。 1.3.2 有丝分裂指数：每10个高倍视野(×400)下核分裂肝细胞数。 1.3.3 肝组织增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen,PCNA)表达：采用免疫组化方法。HistostainTMPlus Kits购自北京中山生物技术有限公司；小鼠抗PCNA多克隆抗体购自中国博士德公司。高倍(×400)视野下计数1000个肝细胞中PCNA阳性细胞数。 1.3.4 大鼠生存状况：每组10只大鼠，观察7 d生存情况。 1.4 统计学分析 所有数据以±s表示。SPSS 10.0软件包进行统计分析，多组间比较采用ANOVA检验，方差不齐则采用KruskalWallis非参数检验。KaplanMeier法绘制生存曲线，LogRank检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 肝质量/体质量比率 如表1所示，Ⅲ组大鼠术后第2、3天肝质量/体质量比率较Ⅰ组及Ⅱ组明显偏低，但到第7天Ⅱ、Ⅲ组动物肝质量/体质量比率明显高于Ⅰ组。表1 各组大鼠肝质量/体质量比率(略) 2.2 肝脏再生率 如图1所示，Ⅰ、Ⅱ组术后肝再生迅速，至术后第7天时分别接近和超过原来肝脏大小，两组再生率比较差异无统计学意义。Ⅲ组术后2～3 d大鼠肝再生率较Ⅰ、Ⅱ组明显偏低。 2.3 有丝分裂指数 Ⅰ、Ⅱ组术后1 d肝细胞出现有丝分裂象，3 d达峰值。Ⅲ组术后2 d才见有丝分裂象，术后3 d分裂指数显著低于其余两组(图2)。 2.4 肝细胞PCNA表达 Ⅰ、Ⅱ组术后即有PCNA表达增加，12～24 h达峰值，以后逐渐下降。Ⅲ组术后12 h内PCNA表达较其余两组明显偏低，48 h才达高峰，至第7天阳性表达仍处高水平(图3)。 2.5 生存状况 Ⅰ组大鼠无死亡，Ⅱ、Ⅲ组大鼠7 d存活率分别为90%和40%。Ⅲ组大鼠存活率较其余两组明显降低(χ2=8.25，5.31，P<0.05 )，生存曲线见图4。3 讨论 肝脏大块组织切除后，可通过残肝的迅速再生来恢复肝脏体积及功能。肝脏再生能力将影响患者的预后。临床研究发现，劈裂式肝移植的效果远低于活体肝移植，两者之间的主要不同在于劈裂式肝移植的移植物经受更长的冷保存时间。为此，我们建立了稳定的大鼠部分肝移植模型，并研究了不同冷保存时间对移植术后肝再生能力和存活率的影响。 Foss等［3］曾经通过CT测体积法动态观察了68%大鼠肝移植后残肝/体质量比率，发现术后同时相点肝移植大鼠的残肝/体质量比率明显高于肝切除，认为肝移植后肝再生能力增强。我们的研究发现，1 h冷保存组肝移植术后3 d内， 移植肝再生率、 肝质量/体质量比率及细胞有丝分裂指数、PCNA表达与肝切除组差异无统计学意义，但至第7天肝质量/体质量比率及PCNA表达差异有统计学意义，肝再生率也存在一定差异。这与Foss的研究相似。造成这种状况的原因可能是：(1)移植肝脏肝损害较重，原位大鼠肝移植24 h后10%～15%肝细胞无活力，从而需要更多的肝细胞来维持机体需要；(2)免疫系统的激活促进肝再生。 Anders等［4］发现淋巴细胞的活化对肝再生有促进作用。我们发现冷保存1 h组和冷保存8 h组术后6 h汇管区即出现各种炎性细胞的浸润，而肝切除组无此改变，提示肝移植后存在免疫系统的激活。这可能与缺血再灌注损伤及同种异基因移植有关［5］。然而冷保存8 h部分肝移植组术后肝再生能力明显受损，表现为术后3 d肝再生率及肝质量/体质量比率、细胞有丝分裂指数明显低于肝切除组，PCNA阳性细胞数在12 h内较对照明显偏低，高峰延迟，阳性细胞强度也较对照组弱，与成峰等［6］的结果相似。众所周知，冷保存主要对窦状内皮细胞及库普弗细胞产生损伤。同时，部分肝移植的过度灌流也会造成窦状内皮细胞等肝脏非实质细胞的损伤［7］。而非实质细胞是各种肝细胞生长因子主要产生来源。库普弗细胞刺激肝细胞生长［8］，对库普弗细胞功能的抑止可损害肝切除后肝再生［9］。因此，我们推测冷保存8 h组肝再生异常可能是长时间冷保存及过度灌流对肝脏非实质细胞功能造成严重损害，导致各种肝细胞生长因子减少，最终导致移植物再生障碍。当然这需要进一步研究。 对3组大鼠7 d存活情况观察发现：肝切除大鼠7 d存活率为100%，1 h冷保存部分肝移植组为90%，两组差异无统计学意义。8 h冷保存肝移植组大鼠存活率下降明显，仅40%，并且大多死于3 d内，而恰恰在术后3 d，其再生受到明显抑制。因此，我们认为移植肝早期再生障碍可能是长时间冷保存后肝移植大鼠存活下降的主要原因之一。 本研究表明：短时间冷缺血对部分肝移植后移植肝再生及存活率无明显影响；长时间冷保存导致部分移植肝再生受损，主要表现为细胞增殖程度及肝质量恢复降低、减慢、延迟，同时存活率明显降低。【参考文献】 ［1］Bilzer M, Gerbes AL. 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