诱骗受体3对大鼠移植肝脏的保护作用

诱骗受体3对大鼠移植肝脏的保护作用作者：王槐志 黎万玲 张玉君 陈志宇 朱瑾 郑平 熊燕 董家鸿    作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院(王槐志、张玉君、陈志宇、朱瑾、郑平、熊燕、董家鸿)， 第三军医大学基础部全军免疫学研究所(黎万玲)    【摘要】  目的 将重组诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)感染移植肝，探讨DcR3对移植肝的保护作用。方法 实验动物分为同基因肝移植组(G1)、同种异体肝移植组(G2)、AAV空病毒感染的同种异体肝移植组(G3)、重组DcR3/AAV感染的同种异体肝移植组(G4)。常规建立同种异体大鼠肝移植模型；术中取预先制备的浓缩1×109 IU病毒颗粒感染移植肝；术后观察大鼠的存活时间、肝功能，荧光显微镜及光镜下观察DcR3在肝脏中的表达及肝脏病理改变。结果 G4组的平均生存时间比G2、G3组显著延长，G2、G3组的平均生存时间差异无统计学意义。G4组大鼠术后15、20 d的肝功能、肝脏病理改变分别与G2、G3组大鼠术后7、10 d相似。结论 DcR3对大鼠移植肝有显著的保护作用。    【关键词】  诱骗受体3； 肝移植； 保护作用； 大鼠　　Protective effects of decoy receptor 3 on rat liver allograft 　WANG Huaizhi, LI Wanling, ZHANG Yujun, CHEN Zhiyu, ZHU Jin, ZHENG Ping, XIONG Yan, DONG Jiahong.　Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China  Corresponding author: DONG Jiahong, Email: dongjh301@163.com    【Abstract】  Objective  To investigate the protective effect of decoy receptor 3 (DcR3) on rat liver allograft by infecting liver allograft with recombinant human DcR3/adenoassociated virus (AAV). Methods  All rats were divided into isogenic liver transplantation group (G1), allogenic liver transplantation group (G2), allogenic liver transplantation group infected by AAV virus (G3) and allogenic liver transplantation group infected by recombinant DcR3/AAV (G4). Rat liver allotransplantation model was established by regular methods. Liver allografts were infected by condensed viral particles (1×109 IU) perioperatively. Survival time of rates and liver function were investigated, and the expression of DcR3 in liver allograft and pathological changes of liver were observed under fluorescent microscope and light microscope. Results  The mean survival time of rats in G4 was significantly longer than that in G2 and G3, with no statistical difference between G2 and G3. The pathological changes of liver and liver function at postoperative days 15 and 20 of G4 were similar to those at postoperative days 7 and 10 of G2 and G3. Conclusions  DcR3 has protective effect on rat liver allograft after liver transplantation.    【Key words】  Decoy receptor 3;  Liver transplantation;  Protective effect;  Rats     诱骗受体3(decoy receptor 3，DcR3)有保护移植物免受排斥反应损伤的治疗潜能［1-2］。腺相关病毒(adenoassociated virus，AAV)可作为诱导肝移植耐受时免疫调节或移植物保护分子转染和表达的理想载体［3-4］。因此本研究将AAV作为其载体转染肝脏，期望实现DcR3蛋白在移植肝中的长期表达，为移植肝提供保护作用， 同时避免其全身性的副作用。1  材料与方法　　1.1  重组DcR3/AAV及AAV空病毒颗粒    取预先制备的浓缩重组DcR3/AAV及AAV空病毒颗粒1×109 IU，用乳酸林格氏液稀释至5 ml备用［5］。AAV病毒中自带的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可作为DcR3表达的标志。　　1.2  实验动物    近交系DA大鼠，质量180～200 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供；近交系Lewis大鼠，质量200～250 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。所有大鼠均在标准条件下饲养，给予啮齿类动物饲料及饮水，遵守实验动物使用和管理准则。　　1.3  动物分组    同基因肝移植组(G1，n=8)：Lewis大鼠为供、受体。同种异体肝移植组(G2，n=10)：DA大鼠为供体，Lewis大鼠为受体，术后不予任何处理。AAV空病毒感染的同种异体肝移植组(G3，n=10)：DA大鼠为供体，Lewis大鼠为受体。切取供肝之后，将AAV空病毒颗粒用乳酸林格氏液稀释至5 ml后经门静脉注入肝脏，同时夹闭下腔静脉两端及门静脉保存30 min，至供肝植入时放开。重组DcR3/AAV感染的同种异体肝移植组(G4，n=10)：所用病毒颗粒为重组DcR3/AAV病毒颗粒，余同G3组。　　1.4  动物模型的建立    采用经典的二袖套法建立大鼠原位肝移植模型。　　1.5  标本采集    于肝移植术后1、3、5、7、10、15、20 d从大鼠尾静脉取2 ml抗凝血。于肝移植术后7、10、15、20 d麻醉状态下开腹取小块肝脏标本，然后关腹让动物继续生存。　　1.6  观测指标    观察大鼠术后一般情况、存活时间至术后25 d。术后存活时间超过24 h视为手术成功。采用Beckman全自动生化分析仪检测肝功能。取不同时相点的肝组织行冰冻切片及常规石蜡切片，同时常规进行苏木精伊红染色，在荧光显微镜及光镜下观察DcR3的表达及肝脏病理改变。　　1.7  统计学分析    结果以±s表示，各组间均数比较采用方差分析。生存时间采用SPSS 11.5软件绘制成KaplanMeier曲线，比较采用对数秩检验(Logrank)。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  一般情况    手术后5 min左右，大鼠即清醒、站立，30 min后能饮水。第2天各组大鼠的精神、食欲稍差，活动较少。第3天各组大鼠的活动、饮食及精神状况恢复正常。G2、G3组大鼠第7天开始出现皮肤、巩膜黄染，尿液发黄，毛杂乱，精神、食欲差，活动减少。G4组大鼠则于第15天开始出现上述表现。G1组大鼠未见异常表现。　　2.2  生存曲线    G1组长期存活，与G2、G3、G4组比较差异有统计学意义(χ2=17.17、17.49、17.69，P<0.05)；G2组平均生存时间(10.9±0.5)d；G3组(11.0±0.6)d；G4组(20.5±0.5)d。G4组比G2、G3组显著延长(χ2=20.67、21.06，P<0.05)，G2、G3组比较差异无统计学意义(χ2=0.13，P=0.713 6)(图1)。　　2.3  肝功能的改变　　2.3.1  术后ALT的变化：各组大鼠肝移植术后第1天ALT显著升高，至第5天左右降至正常。G1组ALT一直维持正常至观察结束。G2、G3组ALT自术后第7天开始显著升高直到受体大鼠死亡。G4组大鼠ALT维持正常，自术后第15天开始显著升高直到受体大鼠死亡。　　2.3.2  术后TB的变化：各组大鼠肝移植术后第1天TB显著升高，至第5天左右降至正常。G1组TB一直维持正常至观察结束。G2、G3组TB自术后第7天开始显著升高直到受体大鼠死亡。G4组大鼠TB维持正常，自术后第15天开始显著升高直到受体大鼠死亡。　　2.4  病理改变    G3、G4组大鼠除肝脏外其他器官包括肺、心脏、脑、脾、肾、胃肠中始终没有GFP表达。G3组大鼠术后7、10 d在荧光显微镜下可见肝脏中有GFP表达，在光镜的同一视野下见肝细胞肿胀，小片状坏死(图2)。G4组大鼠术后7、10 d在荧光显微镜下可见肝脏中有GFP表达，但在光镜下观察完全正常；术后20 d在荧光显微镜下仍可见GFP表达，在光镜的同一视野下开始见肝细胞大片状坏死伴有明显的淋巴细胞浸润，汇管区结构紊乱伴有明显的淋巴细胞浸润(图3)。3  讨论    根据DcR3的作用机制，我们推测DcR3通过下列途经对移植肝功能起到保护作用：与Fas竞争性结合FasL，阻断宿主细胞毒性T淋巴细胞通过Fas/FasL途经杀伤靶细胞［6］；通过阻断LIGHT与LTβR或HVEM/TR2 的相互作用而抑制LIGHT诱导的肝细胞坏死［7］；通过阻止Fas/FasL的相互作用抑制宿主细胞毒性T淋巴细胞的活化，从而减轻宿主细胞毒性T淋巴细胞对肝细胞的损伤。本研究结果证实各组大鼠术后第1天均出现ALT、TB升高，我们认为这与缺血再灌注及手术创伤有关。G4组大鼠术后出现ALT、TB再次升高及肝功能衰竭的时间明显推迟、生存时间显著延长，且其肝脏组织中有GFP表达。我们在以往的研究中已经证实重组AAV病毒中GFP与DcR3的表达是一致的，GFP的表达可以作为DcR3表达的标志［5］。    急性排斥反应发生时，宿主细胞毒性T淋巴细胞首先穿过血管聚集在汇管区，导致血管内皮细胞及胆管上皮细胞水肿、坏死、脱落，出现血管栓塞、黄疸。若炎症不能控制，则进一步扩散至汇管区以外，造成肝细胞变性、坏死甚至整个肝小叶坏死，从而导致移植肝功能丧失。我们观察到G4组大鼠肝脏组织中淋巴细胞的浸润时间延迟、数量减少，病理改变较轻。因此，我们认为DcR3在肝脏组织中的表达抑制了移植肝组织中淋巴细胞浸润的速度及数量并降低其对肝组织的破坏程度，从而对移植肝有保护作用，延长了其生存时间。已知FasL、CXCL12/SDF1α对淋巴细胞有强烈的趋化效应［8］。因此我们推测DcR3可能通过与Fas竞争性结合抑制FasL介导的淋巴细胞向肝脏的迁移、还可通过抑制趋化因子CXCL12/SDF1α在肝脏的表达来减轻宿主细胞毒性T细胞对移植肝的浸润。    由于AAV基因组可定点整合至19号染色体的一个2～4 kb的区域(19q13.32qter)，具有避免插入性突变致肿瘤发生、保证目的基因长期稳定表达的优点［9］。既往的研究还证明AAV能将目的基因高效率地转入并表达于移植肝中，而肝脏外其他器官中没有目的基因的表达。我们观察到在大鼠死亡之前，重组DcR3/AAV感染的G4组大鼠肝组织中仍有DcR3表达，而肝外器官中始终没有转染的DcR3表达。同时我们还证实了其对移植肝有明显的保护作用。因此，我们认为在移植肝存活时间进一步延长的情况下，将AAV作为DcR3载体也可望实现其在肝脏组织中的长期表达，将DcR3蛋白的作用局限在肝脏之中，同时可避免DcR3蛋白的全身性副作用、逆转录病毒及腺病毒载体的缺点，因而具有潜在的临床应用价值。【参考文献】　　［1］Wu Y, Han B, Luo H, et al. DcR3/TR6 effectively prevents islet primary nonfunction after transplantation. Diabetes,2003,52(9):2279-2286.　　［2］Zhang J, Salcedo TW, Wan X, et al. Modulation of Tcell responses to alloantigens by TR6/DcR3. J Clin Invest,2001,107(11):1459-1468.　　［3］Marshall E. Gene therapy′s growing pains. Science,1995,269(5227):1050,1052-1055.　　［4］Streck CJ, Zhou J, Ng CY, et al. Longterm recombinant adenoassociated, virusmediated, livergenerated expression of an angiogenesis inhibitor improves survival in mice with disseminated neuroblastoma. J Am Coll Surg,2004,199(1):78-86.　　［5］王槐志，黎万玲，董家鸿，等.重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达.免疫学杂志，2006,22(5):487-490.　　［6］Pitti RM, Marsters SA, Lawrence DA, et al. Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer. Nature,1998,396(6712):699-703.　　［7］Yu KY, Kwon B, Ni J, et al. A newly identified member of tumor necrosis factor receptor superfamily (TR6) suppresses LIGHTmediated apoptosis. J Biol Chem,1999,274(20):13733-13736.　　［8］Shi G, Wu Y, Zhang J, et al. Death decoy receptor TR6/DcR3 inhibits T cell chemotaxis in vitro and in vivo. J Immunol,2003,171(7):3407-3414.　　［9］Ilan Y, Saito H, Thummala NR, et al. Adenovirusmediated gene therapy of liver disease. Semin Liver Dis,1999,19(1):49-59.