Oddi括约肌肌电活动实验模型的建立

Oddi括约肌肌电活动实验模型的建立作者：李虎城 董家鸿 陈飞 邹一平 李为民    作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院(李虎城、董家鸿、陈飞)； 100091 北京，解放军总医院第二临床部肝胆外科(邹一平、李为民)    【摘要】  目的 建立研究Oddi括约肌肌电活动的动物模型和实验方法。方法 将双极金属钩状电极通过浆膜层置入Oddi括约肌，记录不同条件干预下家兔的Oddi括约肌肌电活动信号，调整电生理实验参数并经放大、滤波及计算机处理后，对其大小、波形、幅度进行分析。结果 不同条件干预下的家兔Oddi括约肌的肌电活动在波形、频率、幅度等方面均有明显的不同，具有明显的规律性。重复实验可得到相似的结果。结论 使用双极金属钩状电极配以合理的电生理实验参数调整可以稳定地采集到在体的家兔Oddi括约肌肌电活动信号。这为今后广泛、深入地研究Oddi括约肌肌电活动搭建了一个技术平台。    【关键词】  Oddi括约肌； 电生理； 兔　　Establishment of myoelectricity model of sphincter of Oddi  LI Hucheng, DONG Jiahong, CHEN Fei, ZOU Yiping, LI Weimin.Institute of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, ChinaCorresponding author: DONG Jiahong, Email: dongjh301@163.com    【Abstract】  Objective  To study the model establishment of myoelectricity of sphincter of Oddi (SO). Methods  Double hook electrode was put into SO through the serous membrance. We recorded the myoelectricity signals of rabbit SO under different circumstances and analysed the size of wave amplitude, frequency and the wave form after adjusting electrophysiological parameters, signal magnification and filtration, computerized processing. Results  The myoelectricity of rabbit SO under different circumstances had different wave amplitude, frequency and wave form, with obvious regularity. The same result could be obtained in repeated test. Conclusions  Stable signal of myoelectricity of rabbit SO in vivo can be collected by double hook electrode combined with appropriate electrophysiological parameters, which provides a technique platform for further study of myoelectricity of SO.    【Key words】  Sphincter of Oddi;  Electrophysiology;  Rabbits    尽管人类发现奥狄括约肌(Sphincter of Oddi，SO)已逾百年，但我们对SO的认识仍很肤浅。临床的诊断和治疗大多基于影像学检查和临床经验，尚缺乏一种客观、直接、量化的诊断标准。基础研究明显滞后于临床。为了解SO的运动规律，我们经过近3年的反复摸索，使用双极金属钩状电极成功地采集到家兔在体的SO肌电活动信号，建立了不同状态下SO肌电活动的实验模型和实验方法，从电生理的角度对SO肌电活动进行了初步研究。1  材料与方法　　1.1  实验动物及分组    健康成年家兔32只，由第三军医大学实验动物中心提供，体质量2.0～3.5 kg，雌雄不分，随机分4组，每组8只。实验前18 h禁食但可自由饮水，实验前4 h禁水。第1组为空腹组，观察空腹状态下SO肌电活动的特点；第2组为进食组，经胃造瘘管注入50 ml牛奶后，观察家兔SO肌电活动的特点；第3组为药物兴奋组，观察吗啡新斯的明激发实验(Nardi test激发实验)后家兔SO肌电活动的特点；第4组为药物抑制组，观察阻断乙酰胆碱能神经元后家兔SO肌电活动的特点。实验环境温度维持在24～28 ℃，肛温维持35 ℃左右。　　1.2  实验仪器及观察指标    双极金属钩状电极采集到的肌电信号，传入SWF1高阻抗微电极放大器，信号放大后传入RM6240型多通道生理仪，然后进入计算机，经专门用于胃肠肌电信号采集处理的软件系统处理后储存。用肌电簇(myoelectronic activity of SO,MASO)及锋电位(spike potentials of SO,SPSO)作为观察指标，分别记录其发生的频率和波幅，每次给药前均在示波状态下做出明显标记。每只动物连续记录120～150 min。　　1.3  实验方法与步骤　　1.3.1  麻醉与显露：家兔按3.5～4.0 ml/kg自耳缘静脉缓慢推注25%乌拉坦，麻醉成功后取腹部正中旁切口约5 cm，逐层进腹，肝下填塞纱布使肝脏上移，十二指肠变浅，将十二指肠上提至切口处并沿肠腔纵轴方向顺时针旋转90～120°，将对系膜缘缝至腹壁固定，使十二指肠乳头充分显露。此时在幽门下方1.5 cm处浆膜下可清晰观察到凸出的乳白色乳头部，质地较硬，大小约0.3 cm×0.3 cm。　　1.3.2  胃造瘘：第2组动物于胃体部行胃造瘘术，置入细导管约3 cm，以灌注食物。　　1.3.3  双极钩状金属电极的制作：把2块有机玻璃打磨成6 cm×0.8 cm×0.5 cm条块，沿纵轴打磨出两条平行凹槽，将2根长12 cm、直径0.35 mm的不锈钢毫针分别放进两条平行凹槽，2块有机玻璃间用黏合剂粘连；前端暴露金属电极约5 cm，用于插入机体内测量肌电，无需绝缘；后端暴露约1 cm，用于连接导联。在有机玻璃条块中段拦腰打磨出一凹槽，以备使用丝线悬吊。于毫针尖端0.5 mm弯曲90°呈钩状，有利于电极的固定。　　1.3.4  测试电极的安置和肌电记录：将实验动物移入PBG1型生理实验屏蔽柜，下肢及屏蔽柜接地以排除外界干扰。直视下将双极钩状金属电极通过浆膜层刺入十二指肠乳头，但不可刺入太深，防止刺透十二指肠肠壁。调整不锈钢万能支架使之保持一定张力和适当的角度；同样方法在十二指肠乳头下方1.0、2.0 cm处分别放置双极钩状金属电极于十二指肠肠壁，用于记录十二指肠肌电变化。每隔1 h浆膜表面喷洒少量生理盐水，防止表面干燥；调整电极的方向使之与地平面成45～60°，并与膈肌运动方向一致。实验参数为：速度500 ms/div、灵敏度1.00 mv、时间参数1 s、滤波频率10 Hz，同时再次叠加10 Hz高通滤波。2  结果　　2.1  胃肠道及呼吸肌肌电活动背景下SO肌电活动规律    在没有滤波的情况下，双极钩状金属电极可以记录到3种肌电活动，即波幅较大、频率较慢的胃肠道肌电活动，约6～8次/min；波幅较小、频率较快的呼吸肌肌电活动，约25～35次/min；规律、单发性的SPSO或MASO，约16～20次/min。将滤波频率降至10 Hz并叠加高通10 Hz数字滤波，再将扫描速度提高到500 ms/div，前2种波形即可被滤过，同时基线变平，仅仅保留清晰的SPSO或MASO(图1，2)。　　2.2  空腹状态下家兔SO肌电活动规律    空腹状态下家兔SO肌电活动表现为规律的、单发性的SPSO，频率0.2～0.4 Hz，最大电位250～375 μV，见图3。　　2.3  进食后家兔SO肌电活动规律    禁食18 h后，通过胃造瘘管注入50 ml牛奶，2 min后家兔SO肌电活动表现为规律的、间断的MASO，频率0.2～0.3 Hz，最大电位350～475 μV，持续约30 min后，逐渐恢复为空腹状态下的SPSO，见图4。　　2.4  药物激发后的家兔SO肌电活动规律    静脉注射1 mg吗啡和1 mg新斯的明后，数秒内SO肌电活动表现为数个长时间、不间断的SPSO组成的肌电串，频率3～4次/ min，最大电位350～625 μV，持续约30～35 min，随后120～150 min内完全抑制，肌电活动基本消失；抑制期过后逐渐出现单个的SPSO，频率0.2～0.4 Hz，最大电位150～300 μV。表现出兴奋-抑制-恢复的规律，见图5。　　2.5  抑制胆碱能神经元后SO肌电活动规律    空腹组家兔在观察记录30 min后，静脉给予山莨菪碱1 mg，SPSO随即消失，120 min后，SPSO逐渐恢复到空腹状态；胃造瘘管内注入牛奶和Nardi test激发实验前，静脉给予山莨菪碱1 mg，上述肌电活动均不再出现，MASO消失持续120～150 min后，逐渐恢复到空腹状态下SPSO，见图6。3  讨论    有关SO相关疾病的诊治是目前临床面对的难题之一，对SO的生理调控和疾病发生机制尚缺乏认识。目前国内对于SO的基础研究开展较少，基本是利用胆道测压的方法［1］。由于胆道压力变化是SO肌电活动的一种表现，且影响因素较多，易造成系统误差。直接检测SO肌电活动较胆道测压更能直接、客观地反映其运动状态。由于SO肌电活动的研究在技术层面上存在很多困难，国内外的基础研究开展均较少且进展缓慢［2-3］。国外有关SO肌电活动的研究基本上采用SO离体实验的方法，电极需要埋进SO内，研究方向亦局限于某一种药物或递质对SO肌电的影响。因此，建立实用的研究SO肌电活动的在体动物模型和稳定的实验方法对开展SO基础研究具有重要意义。　　3.1  实验动物的选择    我们之所以选择家兔进行在体实验，主要基于以下考虑：(1)在体实验较离体实验更加接近生理状态，采集到的数据更加接近实际情况，具有较强的科学性。(2)实验需在屏蔽柜内进行，小动物较大动物更易于操作。(3)家兔的十二指肠完全游离，SO容易暴露，避免了游离和切开十二指肠壁造成的十二指肠和SO血供的减少及生理状态的改变。(4)由于家兔肠壁较薄，在幽门下1.5 cm处浆膜下可清晰观察到凸出的乳白色乳头部，电极可以从浆膜层直接置入SO，有效地避免了胆汁、胰液和肠液的干扰，在实验过程中可保持十二指肠的完整性。(5)家兔的胆道系统与人类相似，具有发达的乳头括约肌，而犬和猪的十二指肠壁较厚，浆膜下无法辨认乳头，因此浆膜下安放电极是不可行的。另外，犬的十二指肠乳头非常平坦，在肠腔内很难辨认，也很难安放电极。经过多次实践我们认为家兔是研究SO肌电活动的比较理想的动物。　　3.2  不同状态下家兔SO肌电活动模式    研究不同状态下SO肌电活动规律需建立以下4种状态的动物模型：空腹、进食、激发和抑制。(1)空腹状态：观察空腹状态下SO处于所谓“关闭”状态下的肌电活动特点。(2)进食状态：观察进食状态下SO处于所谓“收缩”状态下的肌电活动特点。(3)激发状态：通过经典的Nardi test激发实验后观察家兔SO肌电活动的特点。之所以选择Nardi test激发实验，是因为这是影像学用于诊断Oddi括约肌运动功能障碍的经典方法。(4)抑制状态：观察阻断乙酰胆碱能神经元后家兔SO肌电活动的特点。由于SO肌电活动是由兴奋性神经元和抑制性神经元互相作用的结果，而兴奋性神经元的主要作用是释放乙酰胆碱致使平滑肌收缩，阻断神经节后胆碱能神经元可使SO处于舒张状态。实验证明，上述4种状态的动物模型可以充分反映出SO肌电活动的基本规律，在此基础上可以对SO肌电活动进行更加深入的研究。　　3.3  建立该实验方法的意义    (1)首次使用双极钩状金属电极，采用插入式方法，在保持十二指肠完整的情况下，采集到SO肌电活动信号；(2)简化了实验步骤，降低了实验难度并使SO尽可能接近生理状态；(3)摸索出能够稳定、清晰地记录SO肌电活动信号的一系列参数，保证了实验的可重复性和成功率；(4)首次建立了研究SO肌电活动规律的4种动物模型，可以在此基础上对SO基本运动规律做进一步深入研究和作为其他相关实验的参照［4-6］。    SO作为机体功能最为复杂的部位之一，迫切需要加强对其基础研究。建立不同状态下SO肌电活动的动物模型，为今后进一步研究搭建了一个技术平台。如果进一步把SO肌电活动的研究与胆道动力学结合起来，将对SO基础理论的完善及临床治疗具有重要意义。【参考文献】　［1］李桂臣，原春晖，程颖，等.膀胱引流式胰腺移植后Oddi括约肌运动变化的实验研究.中华外科杂志，2004，42(15)：929-931.　［2］Woods CM, Schloithe AC, Simula ME, et al. 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