p16和Ecadherin基因在胃癌中的表达

作者：高鹏作者单位：青岛大学医学院附属医院急诊普外科,山东 青岛 266003 【摘要】  目的 探讨原发胃癌组织P16和Ecadherin蛋白表达与肿瘤发生、发展关系。方法 应用免疫组织化学技术检测80例胃癌及20例胃良性病变组织中P16和Ecadherin蛋白的表达。结果 80例胃癌组织中P16蛋白阴性表达率为78.8%，Ecadherin蛋白减弱表达率为87.5%,和胃良性组织相比，蛋白表达均显著下调（χ2=9.040、58.330，P<0.01）。P16蛋白阴性表达率在淋巴结转移组高于未发生淋巴结转移组（χ2=6.819,P<0.01），Ⅲ＋Ⅳ期胃癌高于Ⅰ＋Ⅱ期胃癌（χ2＝5.711,P<0.05）。Ecadherin蛋白减弱表达率在淋巴结转移组高于未发生淋巴结转移组（χ2＝5.503,P<0.05）,Ⅲ+Ⅳ期胃癌高于Ⅰ＋Ⅱ期胃癌（χ2＝4.156,P<0.05）,随浸润深度的加深，Ecadherin蛋白减弱表达率明显增高（χ2＝6.011,P<0.05）。胃癌组织P16蛋白与Ecadherin蛋白表达呈正相关（χ2＝7.779,P<0.01）。结论 P16、Ecadherin蛋白表达下调在胃癌的发生发展过程中均起重要作用，其蛋白状态可作为判断胃癌生物学行为的重要指标，两者均下调可能提示病人预后不良。 【关键词】  胃肿瘤 p16基因 Ecadherin基因 免疫组织化学    EXPRESSION OF p16 AND Ecadherin GENES IN GASTRIC CARCINOMAGAO PENG, FAN XIAOLIN, WANG PEIGE, et al (Department of Emergency General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of P16 and Ecadherin protein and their roles in the occurrence and development of primary gastric carcinoma. MethodsExpression of protein P16 and Ecadherin in 80 cases of primary gastric carcinoma and 20 benign gastric lesions were detected by immunohistochemistry. ResultsThe negative expression of P16 and attenuated expression of Ecadherin were respective 78.8% and  87.5% in the cancer, which were higher than those in benign one （χ2=9.040,58.330;P<0.01）. The negative rate  of P16 was higher in cases with lymph node metastasis or in patients at Ⅲ＋Ⅳ stage than those without lymph node metastasis or patients atⅠ＋Ⅱ stage （χ2=6.819,5.711;P<0.01,0.05）. The attenuated expression of Ecadherin  was higher in cases with lymph node metastasis or patients at Ⅲ＋Ⅳ stage than those without or patients atⅠ＋Ⅱ stage （χ2=5.503,4.156;P<0.05）. The attenuated  expression of Ecadherin increased along with deepening of tumor invasion （χ2＝6.011,P<0.05）. A positive correlation existed between P16 and Ecadherin expressions in gastric carcinoma （χ2＝7.779,P<0.01). ConclusionThe downregulation expressions of P16 and Ecadherin play an important role in the development and progression of gastric carcinoma. The level of P16 and Ecadherin protein can be used as an important biological behavior marker for the  carcinoma. The downregulation of both P16 and Ecadherin implies a poor prognosis.    ［KEY WORDS］ gastric neoplasms; p16 gene; Ecadherin gene; immunohistochemistry    p16基因作为抑癌基因，其抑癌作用是通过编码的核磷酸蛋白P16ink4与cyclinD竞争与依赖性细胞周期激酶4（CDK4）/CDK6结合，从而阻止细胞从G1期进入S期。大量研究表明，p16基因在肿瘤细胞株及原发肿瘤中频繁缺失，提示其参与了肿瘤的发生发展过程。Ecadherin基因是一种广义的肿瘤转移抑制基因，其蛋白表达产物是钙依赖的上皮细胞黏附分子，分布于同种上皮细胞侧面中间连接处，介导同种亲和性上皮细胞细胞间的黏附，在维持组织结构的完整性和极性方面起重要作用。体外实验证明，其表达下调与细胞分化程度和肿瘤细胞浸润转移密切相关。本文采用SABC免疫组化方法检测原发胃癌组织中的P16和Ecadherin蛋白的表达，现将结果报告如下。

1  材料与方法    1.1  材料及来源    选取青岛市中心医院病理科1998～1999年经病理诊断为原发性胃癌的手术切除标本80例（男57例，女23例，年龄28～81岁，年龄中位数为62.6岁）。依据1988年IUCC分期标准进行PTNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期15例，Ⅲ期29例，Ⅳ期15例；有淋巴结转移者54例，无淋巴结转移者26例；未侵及浆膜者39例，侵及浆膜者41例。病人术前均未进行过放疗及化疗。另取20例胃良性病变组织（为青岛市中心医院1999年胃镜活检组织）作为对照。    1.2  免疫组化方法    标本均常规经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋后存档，4 μm厚切片，行SABC法染色。兔抗人P16多克隆抗体，鼠抗人Ecadherin单克隆抗体及SABC即用型试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司，经微波修复抗原，具体操作按说明书进行，DAB显色。以胃癌组织表达阳性的切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.3  结果判断

    ①P16：细胞膜、胞浆或胞核呈清晰棕色为阳性，阳性细胞数（10 HP）≥25%为P16阳性，无阳性细胞或阳性细胞数<25%为P16阴性［1］。②Ecadherin：阳性反应部位呈棕黄色颗粒状，以正常胃黏膜组织切片为阳性对照，胃癌细胞染色反应强度与正常胃黏膜相似者判为Ecadherin（＋），较正常黏膜减弱者为Ecadherin（±），完全消失者为Ecadherin（－）。根据SHIOZAKI等［2］介绍的方法进行定性和半定量的分类。肿瘤细胞Ecadherin保留表达：所有肿瘤细胞均系Ecadherin（＋）；肿瘤细胞Ecadherin减弱表达：肿瘤细胞染色强度不一，呈（＋）、（±）到（－）均存在为异质性减弱表达；肿瘤细胞Ecadherin基本呈（－）为消失表达。

    2  结    果

    2.1  胃癌和胃良性病变组织中P16与Ecadherin的表达

    80例胃癌组织中，17例P16蛋白表达阳性，阴性表达率为78.8%；20例胃良性病变组织中，11例P16蛋白表达阳性，阴性表达率为45.0%,两组差异有极显著性（χ2=9.040,P<0.01）。80例胃癌组织中，10例Ecadherin蛋白表达阳性，70例呈减弱表达，减弱表达率为87.5%；20例胃良性病变组织均呈阳性表达，减弱表达率为0，两组差异有极显著性（χ2=58.330，P<0.01）。

    2.2  P16蛋白表达与胃癌临床分期的关系

    在伴有淋巴结转移和不伴有淋巴结转移的胃癌组织中，P16阴性表达率分别为87.0%、61.5%,两组差异有极显著性（χ2=6.819,P<0.01）。Ⅰ＋Ⅱ期胃癌P16阴性表达率为66.7%,Ⅲ+Ⅳ期胃癌P16阴性表达率为88.6%,两者差异有显著性（χ2＝5.711,P<0.05）。

    2.3  Ecadherin蛋白表达与胃癌临床分期的关系

    未侵及浆膜者和侵及浆膜者的Ecadherin减弱表达率分别为76.9%、97.6%,两者差异有显著性（χ2＝6.011,P<0.05），随浸润深度的加深，Ecadherin减弱表达率增高。伴淋巴结转移组和无淋巴结转移组Ecadherin减弱表达率分别为94.4%、73.1%,两者差异有显著性（χ2＝5.503,P<0.05）。Ⅰ＋Ⅱ期胃癌Ecadherin减弱表达率为77.8%,而Ⅲ+Ⅳ期胃癌Ecadherin减弱表达率为95.5%，两者比较差异有显著性（χ2＝4.156,P<0.05）。

    2.4  P16蛋白阴性表达与Ecadherin减弱表达的关系

    80例胃癌组织中，P16、Ecadherin共同阳性表达者6例，占全部病例的7.5%;P16阴性表达、Ecadherin减弱表达者59例，占73.75%;P16阳性表达、Ecadherin减弱表达者11例，占13.75%;P16阴性表达、Ecadherin阳性表达者4例，占5.0%。在P16阳性和阴性肿瘤中，Ecadherin减弱表达率分别为64.7%和93.7%,两者差异有显著性（χ2＝7.779,P<0.01）。

 3  讨    论

    p16基因定位于人染色体9p21,其编码产物为P16蛋白。P16蛋白可特异地与CDK4或细胞周期蛋白CDK4复合物结合,抑制CDK4活性,从而抑制细胞由G1期向S期转化,对细胞增殖周期起负性调节作用。p16基因与人类恶性肿瘤的关系密切［3］。基因转染研究结果表明，用p16基因转染癌细胞则出现癌细胞生长的阻抑现象，反之p16基因缺失则导致肿瘤细胞的无限生长［4］。本研究结果显示，p16基因在胃良性病变组织中的阴性表达率为45.0%,而在原发胃癌中阴性表达率为78.8%,提示p16基因失活与胃癌的发生可能有关。伴有淋巴结转移的胃癌，其P16蛋白的阴性表达率高于不伴有转移者，提示p16基因的失活可能与胃癌的淋巴结转移有关。人们在肺癌、大脑胶质细胞瘤与黑色素瘤中，也注意到p16基因失活与各自的转移表型的表达有密切关系［5］。有学者认为p16基因失活的生物学意义可能就在于它使某一细胞亚群获得生长优势，并使这些细胞表现出转移的特征［6］。本研究结果也显示，Ⅲ+Ⅳ期胃癌的P16蛋白阴性表达率显著高于Ⅰ＋Ⅱ期，说明P16蛋白阴性表达与胃癌 的自然病程密切相关，提示p16基因的失活不仅参与了胃癌的发生，亦参与了胃癌的进展过程，是胃癌的一个晚期事件。

    Ecadherin蛋白是介导细胞间及细胞与细胞外基质黏附的主要分子［7］，在维持上皮细胞间连接、控制细胞极性、分化及组织形态的发生等方面起重要作用。Ecadherin蛋白表达减少或缺失后，胃癌细胞间的黏附力减弱，易使癌细胞弥漫生长，不能形成腺管，容易脱落及向远处转移。本研究结果显示，在胃良性病变组织中Ecadherin蛋白均保留表达，而在原发胃癌中其减弱表达率高达87.5%,说明Ecadherin蛋白表达的减弱可能是细胞恶性转化的结果。尽管现已证明Ecadherin蛋白的表达程度及功能活性状态直接影响着肿瘤细胞的脱离和再附着，但其在原发性肿瘤临床病理中的研究结果并不一致。本研究结果显示，侵及浆膜者Ecadherin蛋白减弱表达率明显高于未侵及浆膜者，说明随着浸润深度的加深，Ecadherin蛋白减弱表达率升高，提示Ecadherin蛋白减弱表达可能与浸润深度呈正相关。其机制可能是Ecadherin蛋白的减弱表达导致其介导的细胞细胞间的黏附性降低，使肿瘤细胞得以脱离原发灶并获得穿透基底膜而进入基质的能力。Ecadherin蛋白除具有细胞黏附作用外,还能抑制肿瘤细胞和宿主细胞产生基质金属蛋白酶(MMPs),抑制肿瘤细胞周围基质和基底膜中的各种蛋白成分的降解。Ecadherin蛋白表达降低与多种肿瘤转移有密切关系。本文研究结果亦表明，Ecadherin蛋白减弱表达可能与胃癌的淋巴结转移有关，但其在淋巴结转移的各个步骤中，具体到哪几步起作用和起的作用究竟多大，目前还很不清楚。本研究临床分期资料的分析显示，Ⅰ＋Ⅱ期胃癌Ecadherin蛋白减弱表达率为77.8%,Ⅲ+Ⅳ期胃癌为95.5%,两者差异显著，说明Ecadherin蛋白减弱表达与胃癌的自然病程密切相关，提示该蛋白减弱表达可能与胃癌的进展有关。

    本研究结果显示，在P16阳性和阴性的肿瘤组织中，Ecadherin蛋白减弱表达率分别为64.7%和93.7%,两者差异有显著性，说明Ecadherin蛋白减弱表达更经常出现在P16蛋白表达阴性的肿瘤中，Ecadherin蛋白减弱表达与P16蛋白阴性表达呈正相关，提示两者表达下调可能在胃癌发生、发展过程中具有协同作用。尽管其相关性的机制尚不清楚，但其相关性可为临床预测淋巴结转移趋势、病程进展及预后判断提供有价值的信息。

【参考文献】  ［1］ 赵大华，李玉军，梁超群，等. 胰腺内分泌肿瘤P16，cyclinD1和PCNA蛋白表达［J］. 青岛大学医学院学报， 2004,40(1):4749.

［2］SHIOZAKI H, TABARA H, OKA H, et al. Expression of immunoreactive Ecadherin adhesion molecule in human cancer［J］. Am J Pathol, 1991,139:1723.

［3］邓宏，常喜华，代芊，等. 外源性P16基因对人前列腺癌的作用［J］. 吉林大学学报:医学版, 2002,28(2):151153.

［4］QUESNEL B, PREUDPPMME C, LEPELLEY P, et al. Transfer of P16ink4/CDN2 gene in leukaemic cell lines inhibits cell proliferation ［J］. Br J Haematoc, 1996,95:291.

［5］OKAMOTO A, HUSSAIN S P, HAGIWARA K, et al. Mutation in the P16,P15 and P18 genes in primary and metastasis［J］. Cancer Res, 1995,55:14481451.

［6］LUCA M, RIE S H, GUTMAN M, et al. Abnormalities in the P16 gene in melanoma cells:relerance to tumor growth and metastasis［J］. Oncogene, 1995,10:1201.

［7］BECKER K F, KREMMER E, EULITZ M, et al . Analysis of Ecadherin in diffuse type gastric cancer using a mutation specific monoclonal entibody［J］ . Am J Pathol, 1999,155:18031809.