结核分枝杆菌对于异烟肼耐药的分子机制研究进展

我国耐药结核病疫情严重，一线抗痨药物异胭肼(INH)作为DOTS(直接督导下短程化疗)战略中重要组成药物已被广泛应用于临床，而长期应用异胭肼可诱导结核分枝杆菌的基因变异，使异胭肼耐药性大幅提高。研究表明结核分枝杆菌中的过氧化氢酶-过氧化物酶(kat G)、烯酰脂酰载体蛋白还原酶(inhA)、β-酮酰基酰基运载蛋白合成酶(kasA)、烷基过氧化氢酶还原酶(ahpC)、还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(ndh)和oxyR等等多基因突变与异烟肼细菌耐药性相关，结核分枝杆菌对于异烟肼的耐药基因与耐药机制较为复杂，故将国内外学者关于结核分枝杆菌对异烟肼耐药分子机制的研究情况作一综述。结核病迄今仍是严重危害国人健康的重大公共卫生问题，我国是全球结核病高负担国家且耐药结核病疫情严重，每年中国的结核病新发病例和耐多药结核(MDR-TB)病例数均居世界第二位[1]。耐药尤其是耐多药结核分枝杆菌的出现与传播，成为实现2050年控制结核病全球性目标的致命性威胁[2]。异胭肼(INH)是DOTS(直接督导下短程化疗)战略中的重要组成药物，也是应用最广泛的一线抗痨药物之一。异烟肼在世界范围总耐药率13.3%，中国总耐药率18.96%[3]，故而对于异烟肼耐药及复敏的研究已成为当今热点。　异烟肼对于细胞内、外的生长繁殖代谢旺盛或近乎于静止的结核分枝杆菌均有杀菌作用，对于主要见于PH中性的结核空洞壁和空洞内的A群结核菌(快速繁殖菌)作用最强[4]。INH能够渗入身体各组织内，在干酪样病灶、结核性浆膜腔积液中药物浓度高，IN H易通过血-脑脊液屏障为结核性脑膜炎首选抗痨用药。由于INH具有强效杀菌，不良反应少，具有片剂、针剂剂型，使用方便，价格低廉等优势多年以来在临床上被广泛应用。但有研究表明INH不同于其他抗痨药物，长期使用可诱导结核分枝杆菌基因变异，从而大幅提高INH 耐药性[5]。关于异烟肼的耐药分子机制较为复杂，故将近年来国内外学者研究情况作出综述。INH结构简单仅为一个酰肼基连接于一个吡啶环，INH是一〖JP+1〗种前体药物,通过被动扩散的方式进入增长期的结核分枝杆菌中[6]，进而被结核分支杆菌中的氧化氢酶-过氧化物酶激活。INH活化产生一系列的活性氧和活性有机自由基,攻击主要为细胞壁中的分枝菌酸、也可能包括DNA、脂类等结核分枝杆菌的多个靶点[7],造成被攻击蛋白靶点中的某些基团氧化或酰化,使其一些生理功能丧失而导致细菌死亡。结核分枝杆菌中的过氧化氢酶-过氧化物酶(katG)、烯酰脂酰载体蛋白还原酶(inhA)、β-酮酰基酰基运载蛋白合成酶(kasA)、烷基过氧化氢酶还原酶(ahpC)和还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(ndh)等多基因突变有报道证实与异烟肼细菌耐药性产生相关。1KatG(过氧化物酶)基因过氧化物酶(katG)是唯一能够激活异烟肼的酶，INH进入结核分枝杆菌细胞内，被katG激活氧化成异烟酸，异烟酸作用于烯酞基还原酶,参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NA D，辅酶I)的合成，干扰细胞壁中的分枝菌酸生物合成，使结核分枝杆菌细胞壁的完整性及抗酸性受损。KatG基因突变包括完全缺失,点突变、碱基的插入和缺失，均可造成KatG基因功能的下降或缺失，势必影响KatG对INH的激活，而导致INH耐药。

1.1KatG基因部分突变:KatG基因的突变是导致结核分枝杆菌INH耐药主要成因，在耐药性相关的katG基因突变中,基因315位氨基酸密码子突变的检出率最高，其中第315位丝氨酸→苏氨酸(Ser→Thr,AGC→ACC)的突变频率最高。[9]此位点的基因突变使katG活性位点甲基化，因而其编码的过氧化氢酶-过氧化物酶无法激活INH，导致INH耐药[10]。有研究报道katG基因315位点丝氨酸→天冬酰胺(Ser→Asn,AGC→AAC)(18.18%，2/11)[11],丝氨酸→ 异亮酰胺(Ser→Ile，AGC→ATC)(2.44%，1/41)等等突变均可与异烟肼耐药相关[1 2]。有研究对比了katG315位点基因突变发生率情况：俄罗斯西北地区(93%,191/204)、南非(64%,80/124)、中国(38.6%，39/101)印度(31%,15/49)、新加坡(26%,41/160)、芬兰(7%,4/54)[13]，KatG315突变率差异可能是与所收集标本来源的地域差别相关,另外标本量不足也会引起结果的误差。有研究报道KatG第329位点基因突变天冬酰胺 →缬氨酸(Asn→Val)，该突变使重组KatG过氧化氢酶活性完全丧失导致异烟肼耐药，这可能与天冬酰胺是极性、中性氨基酸，缬氨酸是非极性、疏水性氨基酸，天冬酰胺 →缬氨酸突变氨基酸性质变化较大相关;也可能与在分子结构中329位氨基酸的位置相关[14]。异烟肼耐药菌株的KatG第463位点基因突变精氨酸→亮氨酸(Arg→Leu)，有研究表明该突变并不改变过氧化氢-过氧化物酶的活性,认为KatG基因中R463/L突变无意义[15-16]。因“主要多态性随机重复序列”引起katG基因重排导致katG区域的不稳定而导致katG 463突变，该突变与基因多态性相关。

1.2KatG基因缺失:仅有很小部分耐INH结核菌株katG基因完全缺失，且该菌株对异烟肼高度耐药[17]。1992年Zhang等发现高耐药性菌株(M IC> 50 pg/ml)3株[18],完全为过氧化氢酶阴性，有2株完全缺失kat G基因, 提示是由于katG基因的完全缺失导致其编码产物过氧化氢-过氧化物酶的活性丧失造成对异烟肼高度耐药。KatG是结核分枝杆菌的一种重要防御性毒力决定因子，对细菌生存起到重要的作用,katG缺陷易受到宿主产生的氧化胁迫攻击，故KatG发生完全缺失的概率极小。　

2烯酰脂酰载体蛋白还原酶(inhA)和β-酮脂酰脂酰载体蛋白合酶( kasA)基因烯酰脂酰载体蛋白还原酶(inhA)和β-酮脂酰脂酰载体蛋白合酶(kasA)属于Ⅱ型脂肪酸合酶(fatty acid synthase Ⅱ,FAS Ⅱ)系统，分别由inhA基因和kasA基因编码。FAS Ⅱ 系统多酶复合体与分枝菌酸的合成相关，分枝菌酸是结核分枝杆菌细胞壁的关键成分,与枝菌酸长链脂肪酸合成和延伸相关的酶学催化步骤是INH的攻击目标，故INH破坏了细胞壁，细菌因耐酸性和疏水性丧失死亡。inhA与NADH和3个FAS-Ⅱ复合物结合,与KasA,酰基载体蛋白A cpM形成共价4个亚基的复合体;被活化的INH攻击于靶点后可使成熟的枝菌酸不能产生，同时使已成熟的枝菌酸被不断耗尽。[19]Inh A和Kas A基因的共同过表达与异烟肼耐药相关,而Inh A表达水平改变更能够影响Kas A表达水平[20]。InhA活性位点处的N ADH与活化后的INH共价连接后，影响InhA还原酶活性，起到阻碍分枝菌酸的生物合成杀菌作用;而INH结构基因突变则影响活化的INH与NADH的共价连接，从而破坏INH的作用产生耐药性[21]。KasA和acpM基因分别编码码β-酮脂酰脂酰载体蛋白合酶和酰基载体蛋白，活化的INH与这两种蛋白共价连接，形成三元络合物KasA-INH-AcpM，以阻碍分枝菌酸生物合成;KasA基因突变能够使INH与KasA和AcpM共价连接被破坏而致异烟肼耐药。　　　　　

3烷基过氧化氢酶还原酶(ahpC)基因和oxyR基因　在大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌等天然抗INH的细菌中,oxyR调节子突变对INH敏感性有影响。OxyR蛋白是分枝杆菌一种对抗氧化应激反应的的自我保护方法,OxyR蛋白既是过氧化物威胁的感应器，又可激活过氧化物毒性解除相关酶的表达，而参与katG、ahpC基因的转录[23]。oxyR基因中有很多突变、缺失,其本质上没有活性,结核分支杆菌oxyR基因是一个假基因,与其对INH敏感性无关[24]。AhpC与OxyR邻近,但转录方向相反;ahpC基因启动子位于oxyR-ahpC基因间区域，对于异烟肼耐药的结核分枝杆菌常发生此区域的突变[19,25]。作为KatG活性缺失的补充机制ahpC基因突变时，使烷基过氧化氢酶还原酶表达上调，能够部分或者完全弥补了oxyR基因的缺陷,使细菌对INH产生耐药[26-27 ]。　4ndh基因等其他基因　还有许多基因被报道与结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性相关，如ndh、iniA、iniB、i niC、accD6、efpA、furA、nal等等。其中ndh基因编码NADH脱氢酶,ndh基因突变使NADH氧化受抑制,以致NADH增多，NAD+减少，NADH/NA D+比例改变使INH过氧化被抑制而致耐药。上述基因大多与异烟肼耐药关系尚不十分明确，分子细节尚不清晰，仍需进一步探索研究加以证实。　总之，结核分枝杆菌对异烟肼耐药分子机制十分复杂，涉及诸多基因突变，其分子细节及基因作用至今未能够完全阐明尚存有争议，还有待进一步研究探索。以助于实现对异烟肼耐药的结核分枝杆菌致病病例临床上能更快的诊断和更有效的治疗控制。

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[收稿日期：2013-11-27编校：徐强]