靶向FoxM1基因的短发夹RNA干扰表达载体的构建和鉴定

　　随着社会的发展,恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的第一大杀手,多年的研究已经证实,肿瘤的发生发展涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活。最近的研究显示,叉头盒转录因子M1(forkheadboxM1,FoxM1)刁笠月干细月包垆募[1]、孚1丹泉癌[2]、胰腺癌[割、非小细胞肺癌[4]、脑胶质细胞瘤[5]及宫颈癌等多种恶性肿瘤组织中存在过表达,而抑制FoxM1的表达则可使多种恶性肿瘤细胞的增殖和侵袭能力得到不同程度的抑制。这些现象提示FoxM1基因的异常表达可能是多种恶性肿瘤发生的共同途径。我们前期的研究已经证实,采用RNA干扰技术抑制非小细胞肺癌FoxM1基因的表达可显著抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力。为了进一步研究FoxM1基因在非小细胞肺癌中的作用,我们设计并构建了靶向FoxM1基因的短发夹RNA干扰表达载体质粒。　　1材料和方法　　1.1材料质粒pS⒈EGFR及阴性对照质粒pS⒈nonspeonc由白莉博士提供,其骨架为美国Ambion公司的pSilencer2.1-U6载体。EcoRI、BamHI、HindⅢ限制性内切酶及T4连接酶购自加拿大Fermentas公司;100bpDNAmarker购自TaKaRa公司;DH5α感受态大肠杆菌购自上海申能博彩公司;胶回收试剂盒购自上海华舜公司;质粒抽提试剂盒购自Invitrogen公司。　　1.2方法本研究以pS止EGFR质粒为骨架进行改造,获得表达靶向FoxM1基因的曲RNA表达载体。　　1.2.1shDNA序列设计与合成既往的研究中我们已经获得了有效的靶向FoxM1基因的siRNA序列,以此序列为基础,中间加人TTGATATCCG茎环序列,两端分别加人BamHI和HindⅢ限制性内切酶位点,并以pol作为转录终止子,最终获得的shDNA序列为:正义链:5′GATCCCGCCGGAACATGACCATCAATTGATATCCGTTGATGG-TCATGTTCCGGCTTTTTTCCAAA3′;反义链:5′GGCGGCCTTGTACTGGTAGTTAACTATA-GGCAACTACCAGTACAAGGCCGAAAAAAG_GTTTTCGA3′全长71bp,由上海生工公司分别合成10D。　　1.2.2pS⒈EGFR质粒线性化及骨架回收将pS⒈EGFR质粒进行BamHI、HhdⅡ双酶切,酶切体系如下:BamHI内切酶1ul,HindⅢ内切酶2ul,质粒1ul,BamHIbLlffer2ul,ddH2013ul;37·C水浴过夜。取酶切产物进行1%琼脂糖电泳,割胶回收大片段。　　1.2.3目的基因退火及连接反应分别用15ul退火缓冲液溶解目的基因正义链及反义链,各取2ul,与46ul退火缓冲液混匀,95C水浴5min退火,自然冷却至37C,孵育1h;取退火产物与胶回收的pS⒈EGFR质粒大片段进行连接反应,反应体系及条件如下:退火产物5ul,骨架质粒4ul,10×T4缓冲液2ul,T4连接酶1ul,ddH2011ul;22·C水浴过夜,60C水浴10min后转化大肠杆菌。　　1.2.4连接产物转化大肠杆菌及质粒抽提取5ul连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于含氨苄西林抗性的LB平板,37°C培养过夜。从LB平板上挑取5个单克隆菌落,分别接种5ml含氨苄西林抗性的LB培养基中,37C恒温摇床(200~250〃min)培养8~10h;取云雾状生长的细菌混悬液3ml进行质粒小量抽提。　　1.2.5质粒酶切鉴定及基因测序对小量抽提得到的质粒分别进行EcoRI和BamHI双酶切与E∞RI和HindⅢ双酶切,并对酶切产物进行电泳分析,比较2条小片段的长度,两者相差应为71bp。同时,将电泳条带符合要求的质粒送上海生工公司进行基因测序鉴定。　　2结果　　根据pSilencer2,1—U6质粒图谱分析(图1),因插人的片段在BamHI、HindⅢ酶切位点之间,E∞RI酶切位点位于BamHI位点上游,因此,若目的基因片段插人成功,经I和BamHI双酶切可获得4187bp和334bp两个片段;经E∞RI和HindⅢ双酶切可获得4125bp和405bp两个片段,电泳后获得的2个小条带分别为334bp和405bp,二者相差大小为插入目的基因片段的长度。　　我们基因重组得到pshFoxM1质粒的酶切电泳结果与此相符(图2),因此考虑目的基因片段插人成功。将此质粒送上海生工公司进行基因测序,测序结果提示目的基因片段插人成功,碱基序列正确无误(图3)。3讨论FoxM1(以往也称为Tridcnt、WIN、MPP2或HFH11A)是人Fox转录因子家族中的一种,是幼年哺乳动物完成正常的生长发育必需的转录因子,成年后FoxM1表达量急剧减少,仅在肠道、睾丸等快速增殖的组织中有所表达,而在心脏、肝脏、肺、肾脏及神经系统等终末分化器官中则几乎检测不到。　　但是在胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌、脑胶质细胞瘤等多种恶性肿瘤组织中,FoxM1表达水平再次升高,并且其表达水平的高低与肿瘤的恶性程度及患者的预后高度相关,提示其过表达在肿瘤形成过程中有重要作用。　　研究发现,FoxM1正常生理功能主要是调控细胞周期中G1S期转换及G2ˉM期转换。在G1期,RB抑癌基因是抑制Gl期向S期转化的关键因子。FoxM1可启动S期激酶相关蛋白2和Cdk亚基1蛋白表达,解除Ckd1对Cdk2-cyclinE复合体的抑制作用,进一步使RB抑癌基因磷酸化而失活,从而启动细胞DNA合成。此外,FoxM1还可促进Cdc25A的表达,Cdc25A同样可促进Cdk2-cyclinE复合体的活化进而使RB抑癌基因发生磷酸化而失活[9]。　　在G2期,FoxM1可增加cychnB1和Cdc25B转录使Cdk1活化J,促进细胞从G2期向M期转化。同时,Cdk1水平升高还可进一步活化FoxM1,形成正反馈,加速细胞进入M期。此外FoxM1还调节PLK1、AuroraB激酶、sur访vin等蛋白的转录,对细胞有丝分裂过程中中心粒形成、纺缍体微管附着至着丝粒、纺缍体组装以及中心粒分离起重要作用。　　正是由于FoxM1在调控细胞周期中所起的关键作用,其表达水平的升高可显著提高细胞的增殖能力,使细胞分裂失去控制而产生恶变。　　除此之外,FoxM1转录因子在肿瘤细胞局部侵袭和血管形成方面也具有重要作用。FoxM1基因可通过多种机制增加基质金属蛋白酶2(MMP2)和MMP9的表达和活性。MMP2和MMP9可降解基底膜胶原,其表达和活性增加可使肿瘤细胞突破周围基质,侵袭周围组织。FoxM1还可促进肿瘤细胞血管内皮生长因子表达,从而增加肿瘤细胞血管生成,形成有利于肿瘤细胞生长的微环境,并促进其发生远处转移。　　FoxM1在恶性肿瘤细胞增殖和侵袭转移中的关键作用使其成为当前肿瘤研究的热点。最近的研究已经证实抑制FoxM1表达可显著抑制肝癌、乳腺癌、基底细胞癌及骨肉瘤等多种细胞的增殖能力,并可抑制骨肉瘤细胞和胰腺癌细胞的侵袭转移能力。我们此前的研究也证实在多株非小细胞肺癌细胞中抑制FoxM1的表达也显著降低非小细胞肺癌的增殖和侵袭能力。最近的研究还提示FoxM1的过表达在肺癌细胞对吉非替尼耐药中发挥重要作用。　　RNA干扰技术是一种高效的转录后基因沉默技术,可以高度特异地下调目的基因表达。而shRNA表达载体质粒可使siRNA在细胞内持续表达,获得较持久的RNA干扰作用,甚至可通过G418等药物筛选获得稳定下调某一基因的细胞株。　　为了进一步深人研究FoxM1基因在非小细胞肺癌及其他恶性肿瘤发生发展中的作用和机制,我们设计并构建了靶向FoxM1基因的shRNA干扰表达载体质粒。质粒酶切电泳及基因测序均证实目的基因插入成功,碱基序列正确无误。本质粒采用pSilencer2,1U6载体作为骨架,其中含U6启动子,可使目的基因在真核生物中表达,同时含新霉素抗性,可进行稳定转染细胞筛选,建立稳定表达目的基因的细胞系,为进一步研究FoxMl基因在肺癌等肿瘤发生、转移及耐药性产生过程中的作用和机制奠定了基础。　　参考文献     Kalinichenko VV,Major ML,Wang X. Foxmlb transcription factor is essential for development of hepatocellular carcinomas and is negatively regulated by the p19ARF tumor suppressor[J].{H}Genes and development,2004.830-850.    Bektas N,Haaf At,Veeck J. Tight correlation between expression of the Forkhead transcription factor FOXM1 and HER2 in human breast cancer[J].{H}BMC Cancer,2008.42.    Xia JT,Wang H,Liang LJ. Overexpression of FOXM1 is associated with poor prognosis and clinicopathologic stage of pancreatic ductal adenocarcinoma[J].{H}PANCREAS,2012.629-635.    Kim IM,Ackerson T,Ramakrishna S. The Forkhead Box m1 transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer[J].{H}CANCER RESEARCH,2006.2153-2161.    Liu M,Dai B,Kang SH. FoxM1B is overexpressed in human glioblastomas and critically regulates the tumorigenicity of glioma cells[J].{H}CANCER RESEARCH,2006.3593-3602.    Chan DW,Yu SY,Chiu PM. Over-expression of FOXM1 transcription factor is associated with cervical cancer progression and pathogenesis[J].{H}Journal of Pathology,2008.245-252.    周磊,张萍海,徐欣. 下调叉头转录因子M1基因表达对非小细胞肺癌细胞生长与侵袭能力的影响[J].{H}中华医学杂志,2009,(34):2424-2428.doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2009.34.014.    白莉,祝蓉,陈智鸿. 靶向EGFR基因的siRNA表达载体构建及其生物学效应的研究[J].{H}第三军医大学学报,2005,(23):2307-2310.doi:10.3321/j.issn:1000-5404.2005.23.001.    Wang 1C,Chen YJ,Hughes D. Forkhead box M1 regulates the transcriptional network of genes essential for mitotic progression and genes encoding the SCF (Skp2-Cks1)ubiquitin ligase[J].{H}Molecular and Cellular Biology,2005.10875-10894.    Ma RY,Tong TH,Cheung AM. Raf/MEK/MAPK signaling stimulates the nuclear translocation and transactivating activity of FOXM1c[J].{H}Journal of Cell Science,2005,(Pt 4):795-806.