细胞自噬对吉非替尼抑制肺癌细胞增殖的影响

细胞自噬是细胞利用溶酶体降解自身大分子物质和受损细胞器的生物学过程‘2，形态学上主要表现为细胞质内出现双层膜自噬复合体，内含待降解成分，自噬复合体进一步与溶酶体融合成自噬体，最终胞质成分在自噬体中代谢。细胞自噬在维持细胞内稳态中起着重要作用。细胞白噬与肿瘤之间的相互关系是目前研究的热点，而细胞自噬在肿瘤细胞中发挥何种作用也一直存在争议3一5〕。一方面有研究6。了发现，细胞自噬可以通过抑制内质网逆境反应和I)\A损伤来抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞生存;另一方面，也有研究吕发现，细胞自噬可促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长。因此，在应用药物治疗肿瘤的过程中，细胞自噬的作用相当复杂。

近年来，有研究表明，靶向表皮生民因子受体(epidermal growth factor receptor, E(}FR)抑制齐I{西妥昔单抗(Cetuximab)能诱导A431细胞产生细胞自噬，西妥昔单抗联合细胞自噬诱导物雷帕霉素 (Rapamycin )处理x431细胞能增加西妥昔单抗杀死肿瘤细胞的数量美国iUlemorial Sloan-bettering癌症研究所进行的临床实验‘}·’2表明，细胞白噬诱导药物依维莫司(Everolimus)可以提高古非替尼 ( Gefitinib)治疗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC的疗效:这个发现也得到f其他实验室的验证，意大利科学家T,a _Vlonica等’3发现 E}"el'Olllllns能够恢复耐药NSCLC细胞株H460对 Gefitinil)的敏感性.提ih细胞自噬诱导药物可能通过改变耐药细胞株的敏感性达到增强Gefitin i b治疗 NSCLC的疗效 为了研究Gefitinil。在NSCLC中诱导细胞自噬的可能性以及细胞自噬对Ge"fitinib抑制esCLc细胞增殖的影响，本研究采用Gefitinil。处理1tS(;T,C细胞株 H460.通过检测细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3一俘(microtubule一。ssociaLed protein 1 light chain 3-[3 , MAP1 LC3- II，简称LC3 II)来判断G efitin i b对细胞自噬的诱导作用，然后通过克降形成实验检测 Everolimus对Gefiti nib抑制1SCLC增殖的影响

1材料与方法

1. 1材料 人NSCLC细胞株H460 ( HTH-177)和Calu6 HTH-56购自美国ATCC公司，采月j D}IEIfT培养基 (含10 0lo FB时培养。主要药物和试剂:Gefitinil。和 Everolimns ( Selleck Chem，美国);D1TEl}T、胎牛血清 (FBS)、青霉素一链霉素双抗(Pen-Steep)、Gluta}'T 1X、非必需氨基酸( 1-T F It2 11 E A a ) ,胰酶消化液( TrYPsin- EDT.)及脂质体2000 ( lnvitrogen，美国);兔抗人 LC3,鼠抗人阶actin一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗(Santa Cruz.美国);蛋白酶抑制剂Cocktail ( Merck，德国); 苯甲基磺酞氟( phenjrlmethanesulfonvl fluoride , PMSF ) , \ aF和NaVOa卜海生工生物技术服务有限公司，中国)。主要仪器:二氧化碳培养箱(Thereto，美国);生物安全柜(海尔，中国);普通倒置显微镜(Olympus ,日本);低温超速离心机(Beckman，美国)。

1.2 western blotting法检测LC3蛋白的表达 H460和Calu6细胞复苏后，培养于含l0% FBS, }%Pen-Strep、1%GlutaMa、及1%NEA_}的D }'I E i-T 培养基中细胞准备:当指数期生长、状态良好的 H460和Calu6细胞生长至80%左右时，采用胰酶消化传代.以合适的密度分开至60 mm细胞培养皿内，使第2大加药处理时细胞密度达到60%左右，每种细胞各需接种5皿药物处理:细胞分盘24 h后开始加人Gefitinil〕至终浓度40 N mol/L，药物处理时I司均为2-1 h总蛋白抽提:细胞经药物处理处理24 h 后吸去培养基.PBS洗涤后加入1 x SDS上样缓冲液进行裂解沸水中煮10 min，离心去除细胞碎片， _ } 0 '=(保存二蛋日定量:按照lw-rv assas-进行蛋白定量测定各组中细胞浓度收集细胞，加人裂解液 _50mmol}'L Tris(pH6.8)、100 mmol/L D1"I、2孔 }I>} ,0. I r涅酚蓝、10 i甘油、蛋自酶抑制剂Cocktail (1:X00稀释)、PVISF 1 mmol/1、\TaF 10 mmol/L、 1a1-0一 1 mmol/L每100 mg组织加人1 mL裂解液_.煮沸smin一80〔保存备用。取20 } g总蛋 H十一悦基硫酸钠一聚丙烯酸胺凝胶电泳(sodium dodecc 1 sulfate一polj-acre-lamide gel electrophoresis，SDS- P入G卜’)，然后转膜分别用抗汗actin ( 1 : 1 000稀释)和抗LC3 ( 1:1 000稀释)抗体检测目的蛋白的相对表达量

1. 3 p卜G卜'P-CI-LC3b质粒构建 II460和Calu6细胞在12孔板中培养至80 }7r左右，收集细胞提取总RBA浓度为0. 84 p g/浏·， D(260 mn)/D(280 nm)=2. 02，D(260 nm)/D(230 nm) =2, 26电泳检测尤基因组I}l\A和蛋白污染，2gs rK}:A亮度强于18S rR}A.无明显的RI\ A降解条带出现。取1 1A g细胞的总Rl\ ;A，以(oligo dT为引物进行反转录，得到cDN A。具体操作参照Fermen }as公司反转录试剂盒说明书用hGAPDH引物(产物长度 100 by)进行普通PCR , 28个循环。上样5 p, L电泳检测GAPDH产物的亮度和纯度，条带要求特异单一无基因组污染条带生成，亮度与100 by条带中最亮的500 by条带相当。 以T.C31〕特异性引物(hLC3 b-2)进行PCR得到 LC3b片段，对该片段及pEGFP-C 1载体同时进行 B剖II和母。I双酶切，经胶回收后用Roche T4 DNA ligaae进行连接，室温连接30 min，取2 }}L连接产物转化GeneHog、宿主菌，涂I}m抗性平板37℃过夜。次日，挑4个单克隆小抽酶切鉴定经酶切鉴定4个克隆均为阳性克隆。hLC3b-2开放阅读框(open reading frame , ORF)引物序列:5'-GCCAGATCTCCGTGG G AGAAGACC'I"f CRAG-3'(上游);5'-GACGGTACCCACT GACA ATTTC ATCCCG-3(下游)，测序验证无任何突变。

1.4荧光显微镜观察增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein , EGFP卜LC3b在细胞内的分布 细胞准备:指数期生长、状态良好的H 460细胞生长至80%左右时，采用胰酶消化传代，以合适的密度接种至含载玻片的24孔板内，使第2天转染时细胞密度达30%左右。质粒转染:细胞接种后第2天开始pEGFP-C 1-I .C31。质粒转染，每种质粒共转染 4孔，转染试剂为脂质体2000。药物处理:质粒转染24 h后换液处理，并加人Gefi l in ib(终浓度为 40 O,mol/L)进行处理荧光显微镜观察:药物处理 48 h后，荧光显微镜下观察细胞内荧光的分布状况，并判断是否发生自噬现象 1.}细胞克隆形成实验 H460细胞复苏后，培养于含lOc7c FBS ,1 r/c Pen- S prep、1 % GLmalIa、及1 }c 1'EAA的D1TE1I培养基中指数期生长状态良好的H 460细胞生长至70 rlc 80%后采用胰酶消化传代，计数后梯度稀释，并以 400个细胞/孔的密度接种于6孔板内实验重复 3次。细胞接种24 h后，加人Gelitinih于U Everolimus 处理细胞，根据文献’3参考值及预实验的结果选取药物浓度，其中Gefitinib浓度为0,1和2.5 p,mol/L, Everolimu、浓度为0,0.5,1和2 nmol/L.分}I]设置空白对照组(未加Gefitinib不Il h:ver olimus ) , Gefitinil〕单独处理组、Everolimu、单独处理组及Everol; m u} + (}efitinib联合组每3 -4天换液一次井继续加人相应浓度的Everolimu、或Gefitinib进行处理药物处理lOd后，吸去培养液;I'BS洗涤2次，加人结晶紫染色液进行染色;PBS洗涤，去除残留的结晶紫染色液观察后拍照，显微镜下统讨一克隆数，按>50个细胞的克隆数目进行统计。实验组相对克隆形成率(%)= 实验组克隆总数/对照组克隆总数x 100%;实验组相对克隆形成抑制率(%) =(1一实验组克隆总数/ 对照组克隆总数)x 100%。 Everolimu、和Ge}ltlnlb 协同抑制细胞牛长的判断依据:lhI( F十G)>讯(E)十 IIE}G)一IR(E) xIR(G)。其中IR }E)为Ev<.rolimus 组克隆形成抑制率,IR(G)为Gefitinib组克隆形成抑制率，IR(E+G)为Everolimus + Gefitinib联合组克隆形成抑制率。

1 .6 料以 0. OS 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资无士￡表示，多组间两两比较采用9检验。p< 表示差异有统计学意义

2结果

2.1 Gefitinib诱导LC3 II的累积 U'estem blottinb法检测结果显示，采用40umol/L Gefitiuil。处理H460和Calu6细胞48 h后检测LC3 的表达发现经Gefitiuil〕处理的细胞都有不同程度的 LC3 II累积，而未加Gefitinib处理的细胞则LC3 II累积不明显(图1)

2.2 pF GFP-CI-LC3b质粒构建成功 随机挑选4个克隆，将}Cab经PCRP}及B刻II, hpn I双酶切后克隆至pEGFP-C 1载体中，酶切鉴定和测序鉴定表明基因克隆完全正确(图2)

2.3 pEGFP-CI-LC3b质粒表达LC3蛋自 pEGFP-CI-LC3b质粒构建成功后，将质粒转染 293 T细胞，48 1，后收集细胞裂解液，用LC3抗体检测蛋白表达水平，发现只有转染了pEGFP-C l -LC3 h 质粒能成功表达LC3蛋自，而不转染质粒或者只转染pEGFP-C1质粒的细胞不表达1.C3蛋白(图3)

2.4 Gefitinib诱导LC3分布变化 将构建好的pEGFP-Cl -1.C3b质粒转染至 H460 细胞中，然后用40 p. mol/L Gefitinib处理细胞48 h后观察绿色荧光蛋白(preen fluorescence protein, GFP)的分布，发现经Gefitinib处理后的细胞中Gl}'P分布成散点状，与未经Gefitinib处理组的均匀分布明显不同(图4)。

2. 5细胞自噬诱导剂Everolimus协同Gefitinib对肺癌细胞增殖的抑制 集落克隆形成的体外实验结果见图5 , Everolimus+ Gefitinib联合组处理肺癌细胞H460后，肺癌细胞克隆的大小明显小于Everolimus单独处理组和Gefitinib 单独处理组，同时增强了Gefitinib对H460细胞生长的抑制作用(P < 0. 05。经计算，Everolimu、浓度为 0. 5和1 nmol/L, Gefitinib浓度为1和2.5 },mol/L 时，IR( G+E)>IR(G)+IR(E)一IR(G) xIR(E)，显示出较强的协同作用(表1)

3讨论

Gefitinib是最早运用到治疗NSCI.C的分子靶向药物，于2003年获得美国食品药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准运用于NSCLC的治疗，并于Zoos年获得批准在中国上市。它能够特异性靶向EGFR并抑制它的激酶活性达到抑制肺癌细胞增殖的作用。Gefitinib最初被发现对10%一19% 的NSCLC患者有非常明显的疗效。基因测序结果表明，这些患者EGFR激酶结构域外显子18 } 21 之间存在缺失或错义突变，这些突变导致了EGFR 激酶活性及其对EGFR激酶抑制剂的敏感性均增加。然而，EGFR突变不能解释临床上对所有Gefitinib 治疗有效的病例，约18%患者不存在EGFR激酶结构域突变但获得了部分反应性，同时也有少部分患者存在EGFR突变但并不能从Gefitinib治疗中获益X15一’7]，这些现象表明Gefitinib治疗肺癌的原理和机制非常复杂，需要新的研究来补充和完善，同时也表明Gefitinib治疗NSCLC的疗效仍然存在提高的空间。本实验结果发现，经Gefitinib处理后的细胞中 EGFP呈散点状分布，明显区别于未经Gefitinib处理组的均匀分布，证实了Gefitinib治疗过程中细胞自噬的发生。有研究报道，细胞自噬诱导剂可以增强 NSCLC对Gefitinib的敏感性。本试验结果也证实了细胞自噬诱导剂Everolimus能够促进Gefitinib对耐药的H460细胞增殖的抑制作用。本试验采用集落克隆形成实验在体外测试了细胞自噬诱导剂Everolimus 对Gefitinib抑制肺癌细胞增殖能力的作用，结果发现，Everolimus + Gefitinib联合处理肺癌细胞H460 后，肺癌细胞克隆的大小也明显小于Everolimus单独处理组和Gefitinib单独处理组，同时一也增强了 Gefitinib刘一H460细胞的生长抑制作用(P <0.05)0 经过计算，Everolimus浓度为0. 5和1 nmol/L, Gefitinib浓度为1和2.5 p,mol/L时，IR(G+E) >IR }G) +IR}E)一1R ( G) x IR ( E) ,显示出较强的协lF7 作用。

国外的I期临床试验[11]表明，对Gefitinib不敏感的患者经过Everolimus处理后，Gefitinil〕的疗效明显改善。结合本研究实验结果，提示我们可能已经建立了一个很好的系统来研究Gefitir;b诱导细胞自噬的机制，在此基础上可以通过改变细胞自噬的状态扩大 Gefitinib治疗患者的范围和对一临床肺癌患者的疗效。

哺乳动物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin , mTOR)被抑制后在细胞内能诱导细胞自噬，Gefitinib可能通过靶向EGFR抑制EGFR下游 PI3 K/ AKT/mTOR通路激活细胞自噬n}。Everolimus 作为mTOR抑制剂可能协同Gefitinib抑制mTOR激活细胞自噬o Gefitinib诱导细胞自噬分子的机制以及细胞自噬诱导剂联合 Gefitinib杀伤NSCLC细胞的作用机制将成为未来研究的方向。

H460细胞EGFR没有突变[131所以对Gefitinib 不敏感;但是我们的结果表明，尽管EGFR没有突变，但是可以通过改变细胞自噬来提高Gefitinib对 H460的抑制作用，提示今后可以通过发现新的药物靶点来提高Gefitinib的治疗效果和在非EGFR突变患者中使用Gefitinib的可能，为个体化治疗提供更多的药物靶点和诊断指标。

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