哮喘患者特异性免疫治疗中检测NK 细胞活性的临床意义

　　作者：徐赛芳,应如珍　　作者单位：解放军第85医院哮喘门诊，上海

　　【摘要】 目的探讨在哮喘尘螨特异性免疫治疗中自然杀伤(NK)细胞活性的临床意义。 方法分别检测尘螨过敏的哮喘患者85例，正常对照组30例成人NK细胞活性，并对哮喘患者进行尘螨特异性免疫治疗，治疗前后检测其NK细胞活性及总IgE。结果哮喘患者的NK细胞活性比正常对照组显著减少(P<0.01)，总IgE显著降低(P<0.01)。 结论NK细胞参与哮喘的发病过程，是一种重要的免疫调节细胞。 特异性免疫疗法有助于NK细胞活性增强，降低总IgE水平，从而减少哮喘的发作。

　　【关键词】 自然杀伤细胞 哮喘 特异性免疫治疗

　　Clinical Detection of Nature Killer Activity in Patients with Asthma During Immunotherapy

　　Xu Saifang, Ying Ruzhen

　　Department of Asthma Outpatient, PLA 85th Hospital, Shanghai 200025, China

　　Abstract： ObjectiveTo discuss the importance of the activity of nature killer (NK) cells in the patients with asthma during immunotherapy. MethodsDetection was done respectively in 85 patients with allergy to dermatophagoides farinae and in 30 normal subjects so that their NK cell activity could be compared. Besides, all the patients and the normal subjects were treated with dermatophagoides farinae immunotherapy, before and after which their NK cell activity and IgE were detected. ResultsThe NK cell activity was less in the patients than in the normal subjects (P<0.01) and so was the total IgE level (P<0.01).ConclusionNK cells, which play a role in the process of asthma, act as a kind of important immunity regulator. Immunotherapy is helpful to strengthening NK cell activity and reducing total IgE level. Thus it may reduce the occurrence of asthma.

　　Key words： natural killer cell; asthma; immunotherapy

　　尘螨过敏性哮喘为最常见的过敏性哮喘。我们采用LDH释放法检测尘螨过敏的哮喘患者在特异性免疫治疗前后外周血自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)活性， 以探讨特异性免疫疗法中NK细胞活性的变化及意义。

　　1资料和方法

　　1.1病例选择

　　选择2002年3月—2007年5月我院哮喘门诊就诊的哮喘尘螨过敏者85例进行尘螨特异性免疫治疗。其中男55例，女30例;年龄16~45岁，平均(20.43±3.60)岁。 所有病例均符合以下特点：(1)有典型的哮喘发作和出现症状有明显季节性与可逆性; (2)发作时可闻及哮鸣音;(3)用支气管扩张药后气喘缓解、哮鸣音消失; (4)排除慢性支气管炎及慢性阻塞性肺气肿;(5)至少有尘螨过敏且结果在++以上。 正常对照组共30例，其中男17例，女13例;年龄 16~40岁， 平均(22.32±1.81)岁。 两组之间的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2试验方法

　　1.2.1尘螨过敏原皮试尘螨皮肤点刺液试剂盒购自上海旭东海普药业有限公司。 用乙醇消毒前臂掌侧皮肤， 设立阴性、阳性对照，点刺针蘸取阴性对照、阳性对照和尘螨点刺液点入前臂皮肤， 每2滴间距离不<5 cm 以防止红晕互相融合。 15 min 后观察反应情况，反应比值大于阳性对照丘疹或红晕25%者为阳性。

　　1.2.2NK细胞活性检测效应细胞的制备： 肝素抗凝静脉血3 ml，以PBS液2：1稀释，按常规以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以RPMI1640洗2次，将细胞数调至所需浓度备用。 靶细胞的配置：细胞系K652， 用含10%小牛血清的RPMI1640连续传代， 取传代1~2 d 靶细胞按效应细胞洗涤法洗涤, 最后调整细胞数至所需浓度备用。 细胞毒实验: 试验设NK试验管、自然释放管及最大释放管，用NP40(Nonidet P40， Huka AG)破坏靶细胞作最大释放， 分别加样于96孔酶表板中，37 ℃ 含5%CO2孵箱培养2 h， 然后在孔内加入LDH底物混合液(INT+PMS+辅酶Ⅰ)， 在酶标仪490 nm 波长下读数。NK细胞活性计算：自然杀伤率(%)=(测定管-自然释放管)/(最大释放管-自然释放管)×100%。

　　1.2.3总IgE的检测用同位素放射免疫方法。

　　1.3特异性免疫治疗方法

　　85例尘螨过敏患者进行特异性免疫治疗。 粉尘螨注射液购自上海旭东海普药业有限公司。粉尘螨注射液分别为1：105、1：104、1:103、1:500四种剂型，先用1:105剂量按0.1、0.2、0.3至1.0 ml 递增，上臂外侧皮下注射，每周1次，继用1:104开始从0.1 ml 逐渐递增到1.0 ml，最后1：500剂量同前递增到1.0 ml 作维持剂量，总疗程3~5年。在治疗过程中，有少数患者因呼吸道感染致哮喘发作时曾给抗生素及相应对症处理，进行尘螨特异性免疫剂量按感染前的剂量进行。进行尘螨特异性免疫治疗前后NK活性以及总IgE的检测均在患者病情缓解期进行。

　　1.4统计学方法

　　采用SPSS11.5软件进行统计。 采用成组t检验、配对t检验进行统计分析。 以P<0.05为差异有统计学意义。临床军医杂志第36卷

　　2结果

　　哮喘组NK细胞活性为8.24±2.80，对照组为17.55±2.41，两组间差异有非常显著的统计学意义(t=15.15，P<0.01)。哮喘组免疫治疗前后NK细胞及总IgE变化见表1。表1哮喘组免疫治疗前后NK细胞活性和总IgE比较(略)

　　3讨论

　　NK细胞是一种异质性、多功能的细胞。近年来人们发现NK细胞不仅具有抗肿瘤、抗感染作用，还参与移植排斥反应、自身免疫和变态反应疾病的过程。国外已有研究表明，NK细胞是哮喘发病机制中重要效应细胞之一[1]。本研究结果提示，哮喘组NK细胞活性明显低于对照组(P<0.01)。NK细胞具有很强的合成和分泌细胞因子的能力，其分泌的IL1、IL2、IL3、IL5、IL13、GMCSF和TNFα等具有致炎作用，可促发哮喘，但其也分泌IL10、IFNy等抗炎因子，抑制气道炎症的发生和发展，NK细胞具有抗炎和致炎的双重作用[2]。Walker等[3]用NK1.1单克隆抗体处理C57BL6小鼠的变应性腹膜炎模型，清除NK细胞，结果腹腔灌洗液中与未清除NK细胞的对照组相比，嗜酸粒细胞浸润减少50%以上，灌洗液中IL5水平亦显著降低，表明NK细胞可通过分泌IL5促成变应性炎症反应。Korsgren等[4]在C57BL6小鼠的哮喘模型研究中，分别在致敏前和激发前用NK1.1单克隆抗体处理小鼠，结果在致敏前去除NK1.1细胞可抑制嗜酸粒细胞及CD3T细胞肺浸润，并且小鼠肺泡灌洗液中IL4、IL5和IL12水平升高受到抑制，另外小鼠血中抗原特异性IgE和IgG2a降低，脾脏中产生IL4和IFNy 的细胞明显减少;在激发前去除NK1.1细胞并不影响嗜酸粒细胞肺浸润。表明NK细胞在过敏性哮喘的致敏阶段中发挥重要的作用，可能是通过影响抗原递呈过程以及T细胞分化而发挥作用。我们研究中也发现哮喘患者NK细胞胞浆嗜苯胺蓝颗粒中存在着大量蛋白酶及穿孔素，显著高于正常对照组，可能与气道炎症反应有关。研究已证实多种免疫细胞及细胞因子参与气道的炎症反应，NK细胞在哮喘炎症机制中的地位和作用也已引起医学界的重视，此研究将为哮喘防治提供重要的理论依据。哮喘主要与外界环境中的过敏原物质有关，过敏原漂浮在空气中，被过敏体质的人吸入后产生呼吸道致敏作用而发病。因此确定过敏原对哮喘的病因诊断有重要的意义，而特异性免疫治疗在过敏性哮喘的治疗中也具有重要的地位。在过敏原中，尘螨过敏尤为多见。因此采用尘螨特异性免疫疗法治疗哮喘，已成为哮喘专科医师的重要措施之一。我们随访了85例坚持进行并完成尘螨特异性免疫疗法的哮喘患者，并对其总IgE和NK细胞活性进行了治疗前后的检测和比较。结果发现特异性免疫后NK细胞活性有显著的升高(P<0.01)，总IgE显著降低(P<0.01)。特异性免疫疗法能使哮喘患者体内产生阻断性抗体，减少特异性IgE抗体产生，从而减少总IgE的生成，且能抑制嗜碱粒细胞和肥大细胞释放组胺，使与细胞结合的IgE减少，使患者增强对抗原的耐受而获得一定的疗效。根据我们的试验结果，特异性免疫疗法还可以增强NK细胞活性，增强患者的非特异性细胞免疫功能，从而减少病原体感染，减少哮喘的发作。

　　【参考文献】

　　[1]Mc Dermott JR,Humphreys NE,Forman SP,et al. Intraepithelial NK cellderived IL13 induces intestinal pathology associated with nematode infection[J].J Immunol,2005,175(5):3207-3321.

　　[2]Moretta L, Biassoni R, Bottino C, et al. Human NKcell receptors[J].Immunol Today,2000,21(9):420-422.

　　[3]Walker C,Checkel J, Cammisuli S,et al. IL5 production by NK cells contributes to eosinophil infiltration in a mouse model of allergic inflammation[J].J Immunol,1998,161(4):1962-1969.

　　[4]Korsgren M,Persson CG,Sundler F, et al.Natural killer cells determine development of allergeninduced eosinophilic airway inflammation in mice[J].J Exp Med,1999,189(3):5553-5562.