初次诊断的特发性间质性肺炎患者外周血DcR3含量的检测

　　作者：乔俊华,安继红,马忠森,杨洋,吴春风,于　　作者单位：吉林大学第二医院，吉林 长春

　　【摘要】目的 检测初次诊断的间质性肺炎(IIP)患者血清中DcR3水平的变化并探讨其临床价值。方法 采用双抗体夹心BASELISA法和RTPCR分别检测103例IIP患者和81例健康对照组血清中DcR3水平和外周血PBMC中DcR3基因相对表达水平。结果 IIP组血DcR3水平〔(3.825 2±1.421 8)ng/dl〕高于正常对照组〔(1.007 9±0.479 3 ng/dl)〕(P<0.01);IIP组患者PBMC中DcR3基因的相对表达水平(0.421±0.076)高于正常对照组(0.213±0.067 )(P<0.05)。结论 检测血清DcR3水平有助于诊断早期IIP。

　　【关键词】 间质性肺炎;DcR3

　　近年来的研究发现，多种疾病如否性肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥等均与DcR3具有相关性。目前对DcR3表达研究多采用Northern blot、Western blot和免疫组化等方法，对血清DcR3的定量检测少有报道。笔者利用本室合成的DcR3抗体和本室建立的双抗体夹心BASELISA方法对初次诊断的特发性间质性肺炎 (IIP)患者以及健康对照者的血清DcR3含量进行比较，观察血清DcR3水平与IIP的相关性，从而为IIP的诊断提供一个简捷方法，为IIP治疗提供可参考的途径。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　我院2007年9月至2008年8月住院的初次诊断(病程<3个月)IIP的患者103例，其中男57例，女46例，年龄45～71岁，平均54.6岁，均符合2000年美国胸科学会(AST)和欧洲呼吸学会(ERS)共同提出的IIP临床诊断标准;健康对照81例，男性48例，女性33例，年龄42～68岁，平均53.3岁，为各项检查正常的体检人员。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　十二烷基肌氨酸钠、DEPC购自Sigma 公司，Oligo d(T)、AMV 逆转录酶、RNA 酶抑制剂、Taq DNA 聚合酶、细胞分离液等购自Promega公司 。引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。双抗体夹心BASELISA试剂盒为本研究室提供。高速低温离心机HERMLEZ383K (HERMLELABOTECHNIK，GERMANY)，凝胶电泳成像分析系统Tannon GIS1000( Tannon 有限公司，上海)，纯水系统MILIPORE(MILIPORE Com，USA)，深低温冰箱Formo (Formon Com，USA)，恒温水浴箱DK28D(上海医用恒温设备厂)，PCR 仪FeroTec (杭州PCR 仪有限公司) 。

　　1.3 方法

　　1.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)

　　研究对象各取静脉血5 ml，肝素抗凝;加入含 5 ml淋巴细胞分离液的离心管中，离心2 000 r/min，20 min，可见血浆与分离液的界面上有一白膜层，此即所需的 PBMC。吸出细胞至另一试管用生理盐水洗 3 遍，离心 2 000 r/min，5 min，弃上清。

　　1.3.2 双抗体夹心BASELISA法检测血清中DcR3水平

　　取1.3.1步骤中所得血浆作为标本，双抗体夹心BASELISA 操作过程参照试剂盒说明，分别用 B10RAD550 型酶标仪测定450 nm的A值，绘制标准曲线，计算样品中 DcR3含量。

　　1.3.3 人PBMC总RNA的提取

　　在上述 PBMC标本中加入变性裂解液Trizol 1 ml 吹打使细胞充分溶解，置室温 5 min后加入氯仿200 μl，剧烈震荡15 s，室温5 min，4 ℃12 000 r/min离心15 min，取上清加入等体积的异丙醇，混匀后-20℃ 1 h，4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入 75%乙醇1 ml，4℃ 7 500 r/min离心5 min，吸去乙醇自然干燥10～20 min，溶于10 μl DEPC水中。此即人外周血总 RNA。

　　1.3.4 逆转录合成cDNA

　　在上步得到的10 μl模板RNA中，加入1 μl DEPC水，1 μl引物Oligo d(T)，稍离心，100℃沸水1 min;加入2 μl dNTP，4 μl 5×buffer,2 μl AMV逆转录酶，稍离心，42℃水浴90 min;沸水3 min，灭活AMV，得到总cDNA。

　　1.3.5 聚合酶链反应PCR 扩增DcR3基因(214 bp)和βactin 基因(570 bp)

　　引物序列：DcR3 基因引物正义链为5′TCAATGGCCAGGCTCTTC3′，反义链为5′GCCTCTTGATGGAGATGTCC3′;βactin 基因引物正义链为5′TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA3′，反义链为5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG3′。

　　1.4 统计学处理

　　血清中DcR3含量及外周血PBMC DcR3 mRNA水平以x±s表示，两总体均数比较采用t检验，以简明统计软件(CS10.32) 进行统计学分析。

　　2 结 果

　　2.1 血清DcR3含量

　　IIP组血清DcR3含量〔(3.825 2±1.421 8) ng/d〕显著高于健康对照组〔(1.007 9±0.479 3) ng/d〕(P<0.01)。

　　2.2 IIP患者组与健康对照组DcR3基因mRNA表达的比较

　　IIP患者与健康人均检测到 DcR3基因的表达，DcR3基因电泳条带显示在214 bp处，与预先设计的片段大小一致;内参照基因片段570 bp也全部可见条带。DcR3 基因在IIP患者PBMC中高水平表达(0.421±0.076)，健康人呈低水平表达(0.213±0.067)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　近年Wu等〔1〕报道通过ELISA方法检测了146例肿瘤患者血清DcR3水平，结果显示56.2%(82/146)肿瘤患者血清DcR3阳性，其中检测阳性者几乎(82/83)均为恶性肿瘤患者，而97.9%正常人和急性感染患者DcR3阴性。同时，该研究还发现在胃癌患者血清DcR3水平与分化程度、TNM分期密切相关，当肿瘤切除治疗后，血清DcR3水平急剧下降，可见DcR3不但有助于恶性肿瘤的诊断，术后检测DcR3水平还有助于判断肿瘤是否切除完全或有无复发。随后Chen等〔2〕同样利用ELISA方法意外发现肾功能不全患者血清DcR3水平显著增高。除肺癌外，目前对其他呼吸系统疾病的可溶性DcR3水平的检测未见报道，前期笔者通过定量RTPCR方法发现DcR3基因在特发性肺间质纤维化(IPF)患者PBMC中表达明显高于健康人，DcR3基因表达水平与IPF患者肺限制性通气功能障碍、弥散功能障碍呈正相关〔3〕。本文以健康体检者为对照，通过双抗体夹心BASELISA方法进一步检测了IIP血清DcR3含量，结果表明：IIP患者血清DcR3水平显著高于正常对照组(P<0.01)。笔者选择了病程<3个月的初次诊断IIP患者，且样本量是目前文献报道最大的，因此可以说明DcR3的检测可以早期诊断IIP。

　　IIP是以干咳、进行性劳力性气促为主要临床表现的一种肺炎。其病理特点为上皮细胞损伤、基底膜脱落、间质炎症、成纤维细胞增殖、细胞外基质增加、胶原沉积及肺泡气体交换单位重塑等〔4〕。该病发病机制尚未完全阐明，一般认为在肺纤维化形成过程中，首先在各种致病因素作用下，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤，形成肺泡炎的初始阶段，随后病变进一步发展，炎症细胞和免疫效应细胞进入肺内并激活、释放各种活性介质，在各种免疫细胞及其介质的作用下，成纤维细胞的活化增殖，胶原生成增多，细胞外基质沉积，最终导致肺纤维化的形成。近年来有学者认为肺泡或支气管上皮细胞过度凋亡在肺纤维化的发生发展中起到重要的作用〔5〕。研究表明向大鼠支气管内注入Fas抗体诱导了细支气管和肺泡上皮细胞的凋亡，1 w后发现有肺纤维化反应〔6〕。应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂(zVADfmk)可阻断肺纤维化模型中肺泡上皮细胞的凋亡，减少胶原基质沉积〔7〕。Monks〔8〕根据IPF时Fas水平增高，推测上调肺泡上皮细胞及血管内皮细胞凋亡，引起I型上皮细胞及肺泡毛细血管膜受损。同时凋亡细胞刺激周围的正常细胞使TGFβ及细胞外基质的合成功能紊乱，导致纤维组织增生、胶原沉积，最终导致肺的弥散功能障碍。由上可见，早期肺泡上皮细胞和血管内皮细胞凋亡过度、修复增加，而后期炎症和免疫活性细胞凋亡不足、清除减少可能导致了间质性肺疾病(ILD)发生发展。

　　Fas/FasL是最主要的凋亡途径，DcR3可与Fas竞争FasL，抑制凋亡，故推测DcR3与IIP相关。本研究检测了103例初次诊断的病程小于3个月的IIP患者，其血清DcR3的水平代表了IIP的早期病变，符合上述推测。但随着病程的进展，DcR3的水平增高是促进IPF的发生发展抑或是对机体的一种保护性反应还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Wu Y,Han B,Sheng H,et al.Clinical significance of detecting elevated serum DcR3/TR6/M68 in malignant tumor patients〔J〕.Int J Cancer,2003;105(5):72432.

　　2 Chen J，Zhang L，Kim S.Quantification and detection of DcR3，a decoy receptor in TNFR family〔J〕.J Immunol Methods,2004;285(1):6370.

　　3 吴艳峰,杨俊玲,马忠森，等.DcR3基因与特发性肺纤维化肺功能的相关性研究〔J〕.中国老年学杂志,2004;24:8945.

　　4 Selman M,King TE,Pardo A,et al.Idiopathic pulmonary fibrosis：prevailing and evolving hypotheses about its pathogenesis and implications for therapy〔J〕.Ann Intern Med,2001;134(2):13651.

　　5 DosReis GA，Borges VM.Role of Fasligand induced apoptosis in pulmonary inflammation and injury〔J〕.Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2003;2(2):1617.

　　6 Hagimoto N，Kuwano K，Miyazaki H,et al.Induction of apoptosis and pulmonary fibrosis in mice in response to ligation of Fas antigen〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,1997;17(3):2728.

　　7 Wang R，Alam G，Zagarlya A，et al.Apoptosis of lung epithelial cells in response to TNFalpha requires angiotensin II generation de novo〔J〕.J Cell Physiol,2000;185:2539.

　　8 Monks J，Geske FJ，Lehman L,et al.Do inflammatory cells participate in mammary gland involution〔J〕? J Mamm Gland Biol Neoplasia,2002;7(2):16376.