siRNAMed19对人肺癌A549细胞Med19转录、表达的影响

作者：李金东,孙梅,高楠,罗树生,王荣有,金成　　作者单位：吉林大学第二医院胸外科，吉林 长春 

【摘要】目的 研究siRNAMed19对人肺癌A549细胞Med19的影响。方法 利用前期已合成的siRNAMed19慢病毒载体，感染A549细胞，并以无病毒感染组作为空白对照组，以慢病毒载体感染组作为阴性对照组。采用荧光图片和白光图片对比方法判断细胞的感染率；RTPCR法检测细胞Med19mRNA的转录水平； Western 印迹法检测细胞Med19蛋白表达水平。结果 慢病毒载体对人肺癌A549细胞的感染率在80%以上，siRNAMed19慢病毒感染组Med19mRNA转录水平明显降低，敲减效率大于70%，Med19蛋白表达量也明显降低。结论 siRNAMed19慢病毒载体可以高效感染人肺癌A549细胞，siRNAMed19对A549细胞Med19的转录和表达具有明显的抑制和消减作用。【关键词】  siRNA；Med19；肺癌；A549细胞肺癌的治疗效果近年仍不理想，总治愈率约10％。Med19是RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的重要组成部分，理论上阻断肿瘤细胞中Med19基因可起到治疗肿瘤的作用。迄今无关于siRNA沉默人类肺癌细胞内Med19基因诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长、转移的研究。本文观察siRNAMed19慢病毒载体对人肺癌A549细胞Med19表达的干扰作用, 探讨Med19基因在肺癌发生发展中的作用, 并为RNAi分子靶向基因治疗人非小细胞肺癌(NSCLC)提供新的实验依据。　　1  材料与方法　　1.1  主要试剂及材料  BCA Protein Assay Kit 购自 HyClonePierce，ECLPLUS/Kit购自Amersham公司，抗羊Med19购自Abcam公司，抗鼠IgG购自Santa Cruz公司， PCR用试剂、引物购自上海吉凯基因技术有限公司，胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司，Trizol购自Invitrogen, dNTP、MMLV逆转录酶、Rnase抑制剂购自Promega公司，oligo dT购自上海生工， A549细胞购自中科院细胞库，pcDNA3.1(-)Med19siRNAGFP、pcDNA3.1(-)Med19NCGFP慢病毒载体均来自本实验室, 滴度为4×108 TU/ml。　　1.2  肿瘤细胞培养及传代  从液氮罐中取出人肺癌A549细胞，常规方法复苏，重悬细胞，接种至培养皿中，晃匀后置37℃、5%CO2培养箱培养。次日更换1次培养液。将生长90%汇合的细胞进行传代，连续传代20次后获得相对纯净的肿瘤细胞用于实验。　　1.3  慢病毒载体感染人肺癌A549细胞  取对数生长期的A549细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液接种于6孔板中的3个孔，每孔细胞数约5×104。空白对照组不加入任何病毒，阴性对照组加入pcDNA3.1(-)MedNCGFP慢病毒，siRNAMed19慢病毒感染组加入pcDNA3.1(-)Med19RNAiGFP慢病毒。感染3 d后观察慢病毒报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，用荧光显微镜观察有荧光细胞的数量来判断感染率。感染率大于50%者继续培养，待感染时间达到5 d后收集细胞抽提RNA进行RTPCR检测。　　1.4  RTPCR检测  常规法提取总RNA，紫外分析测定RNA浓度，经逆转录获得cDNA，置于-80℃保存备用。Med19(222 kb)和βactin(214 bp)上、下游引物分别为：βactin上游5′TCGTGCGTGACATTAAGGAG3′,下游5′AAGGTAGTTTCGTGGATGCC3′和Med19上游5′GTAACTTCCTGCCTGACCTG3′,下游5′TGTGCTTGTGCTTATTCTTCTTC3′。采用标准曲线分析法（2-ΔΔCt分析法）分析每一标本的Med19mRNA的表达水平。　　1.5  Western印迹检测  准备靶细胞及6孔板中每孔样品排列、细胞慢病毒感染操作同上。从培养箱中取出细胞，弃去培养液，PBS洗涤2次,弃去PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，细胞刮刮下细胞，将样品转移入1.5 ml Eppendorf管中，冰上裂解细胞10～15 min,超声破碎仪破碎细胞。4℃，12 000 r/min，离心15 min。取上清，测蛋白浓度后，每个样品蛋白终浓度均调整为2 μg/μl，每个样品取相同蛋白量在10%聚丙烯凝胶条件下进行SDSPAGE。电泳后转移到NC膜上，5%脱脂牛奶TBST溶液封闭过夜后洗膜，加入1∶200稀释的羊抗Med19，TBST洗膜3次，每次10 min。用封闭液1∶6 000稀释抗鼠IgG，室温下孵育PVDF膜2 h。TBST洗膜3次，每次10 min，Western印迹试剂盒显色，X光显影，取出X光片，晾干，分析，以GAPDH为内参。　　1.6  流式细胞仪检测细胞周期和凋亡  用胰蛋白酶将细胞消化并收集在离心管中，以预冷的0.01 mol/L PBS冲洗细胞3次，每次均需打散细胞。最后用0.5 ml PBS重悬细胞，逐滴加入预冷的75%酒精中固定。碘化丙啶染色，流式细胞仪检测。　　1.7  统计学处理  采用SAS8.2统计软件分析，进行t检验。　　2  结果　　2.1  Med19siRNAGFP和 Med19NCGFP慢病毒载体对A549细胞的感染  见图1。空白对照组未见荧光，阴性对照组及敲除组细胞荧光感染效率大于80%。　　图1  三组细胞荧光观察结果（略）　　2.2  RTPCR方法检测siRNAMed19对A549细胞Med19基因转录的影响  siRNA慢病毒感染组Med19mRNA 表达水平（0.178±0.042）较空白对照组（0.617±0.089）及阴性对照组（1.002±0.075）明显减少（P＜0.05），熔解曲线：actin和Med19的扩增产物溶解曲线，没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。　　2.3  siRNAMed19对A549细胞Med19蛋白表达的影响  siRNAMed19慢病毒感染组中Med19蛋白的表达明显减弱，光密度分析与空白对照组及阴性对照组明显减弱，各组内参GAPDH表达量无显著差异(图2)。　　图2  Western印迹扫描图（略）　　2.4  siRNAMed19对A549细胞生长周期的影响  流式细胞仪分析结果显示，实验组与其他两照组相比较，在正常二倍体细胞的G0G1期前出现的一个亚二倍峰即为凋亡峰，提示siRNAMed19转染人肺癌A549细胞后，可诱导癌细胞周期停止在G1期，抑制肺癌细胞的分裂增殖，促进细胞凋亡。　　3  讨论    　前期工作中，我们设计合成siRNAMed19慢病毒载体,可以稳定地表达siRNA,而且具有高转染效率(转染效率大于80%) ，较长时间的持续效应和较为明显的蛋白敲减效果。本次实验将构建的siRNAMed19慢病毒载体转入人肺癌A549细胞，研究其对Med19基因转录和表达的抑制作用。        外科手术一直以来是肺癌综合治疗的最重要的手段之一。虽然手术技术及方式进步很快，但对提高生存率的作用有限，放化疗效果同样不佳，故人们正在寻求疗效更好,毒性更低的治疗方案以提高患者生活质量。        siRNA介导的RNAi技术是近年发展起来的一个崭新的研究领域 ,它的发现为基因功能探索、基因治疗提供了一种全新、 高效的研究手段。RNAi技术因其特异性和高效性已成为研究基因功能的重要工具〔1〕,具有其他基因封闭技术无法比拟的特点和优势〔2〕。siRNA又被称为转录后基因沉默〔3〕，其机制是细胞内的dsRNA被 Dicer (一种RNA酶Ⅲ)剪切成双链的siRNA , 与RNA诱导的基因沉默复合物结合 ,降解与之互补的靶mRNA，特异性抑制靶基因表达〔4〕。自Fire等〔4〕发现 dsRNA能引起特异性基因沉默以来, RNAi 技术因有望成为理想的基因转移载体。有实验报道使用慢病毒载体稳定介导基因沉默达 25 d 之久〔5,6〕。也有实验采用慢病毒载体成功转染了一些包括原代细胞、 终末分化细胞等难以转化的细胞,适合于对目的基因进行较长时间的研究〔7〕。         Med的细胞外功能包括促进激活的转录、增强基础转录、增强（CTD）的磷酸化。Med19在酵母菌的曾用名为ROX3（或SSN7、RMR1等），酵母菌及人类的Med在结构和功能上惊人地保守〔8〕。Med19在人类编码的基因名为肺癌转移相关蛋白(LCMR1)。LCMR1基因直接或间接参与和介导了多种信号途径，在具有高转移能力的人肺癌95D细胞系中高表达。但真核生物转录调控的情况相对复杂，除了复杂的原核染色质结构外，真核调节蛋白与RNA聚合酶的相互作用还需要多个亚基组成的蛋白质复合体，即Med来介导形成全酶才能完成转录〔9〕。含有不同激酶组件的Med复合物可对不同类型的基因起到调节作用〔10〕。Med的构象改变会产生一个对RNA聚合酶Ⅱ在内的PIC组件进行募集和组装的表面，这是Med在转录调解中发挥作用的重要方面〔11〕。        我们构建siRNAMed19慢病毒表达载体，利用RNAi技术沉默肺癌细胞中Med19基因，可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长、为后续实验及其在肺癌治疗中的应用提供了理论依据。通过siRNA来介导RNAi干扰作用,从而抑制肿瘤组织中Med19基因的表达,对于治疗肺癌可能具有重要意义。慢病毒通过病毒衣壳糖蛋白与细胞膜上的特异受体结合而进入易感靶细胞。病毒RNA逆转录合成双链线性 DNA而转运至细胞核。线性病毒DNA永久性地整合入染色体 DNA (宿主基因组)中 ,形成前病毒,在细胞周期中与靶细胞基因一样复制,并稳定表达与传给子代细胞。本研究针对人肺癌A549细胞Med19基因构建siRNA慢病毒为载体 ,将该载体导入A549细胞内持续表达,细胞生长速度明显减慢,提示RNAi抑制Med19基因表达后可以显著抑制A549细胞增殖能力。通过RTPCR、Western印迹等方法，证实siRNAMed19成功地抑制了人肺癌A549细胞内Med19 mRNA和蛋白的表达，为后期研究Med19基因在人NSCLC中的作用机制和基因治疗打下基础。【参考文献】    1 Mc Manus MT, Haines BB, Dillon CP, et al. Small interfering RNA mediated gene silencing in T lymphocytes〔J〕. J Immunol,2002;169(10)：575460.

　　2 Hannon GJ. RNA interference〔J〕. Nature, 2002;418(6894)：24451.

　　3 王春光，王荣有，孙 梅，等.沉默基因表达对肺癌细胞生长影响的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2006；26（2）：2103.

　　4 Fire A, Xu S, Montgomer MK, et al. Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans〔J〕. Nature,1998;391(6669)：80611.

　　5 AbbasTerki T, BlancoBose W, Deglon N, et al. Lentiviral mediated RNA interference〔J〕. Hum Gene Ther,2002;13(18):2197201.

　　6 Stewart SA, Dykxhoorn DM, Palliser D, et al. Lentivirusdelivered stable gene silencing by RNAi in primary cells〔J〕.RNA,2003;9(4):493501.

　　7 Cockrell AS, Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors〔J〕. Mol Biotechnol, 2007;36(3)：184204.

　　8 Conaway RC, Sato S, TomomoriSato C, et al. The mammalian mediator complex and its role in transcriptional regulation〔J〕. Trends Biochem Sci, 2005;30(5)：2505.

　　9 Baumli S, Hoeppner S, Cramer P. A conserved mediator hinge revealed in the structure of the MED7.MED21 (Med7.Srb7) heterodimer〔J〕. J Biol Chem,2005;280(18)：181718.

　　10 Dotson MR, Yuan CX, Roeder RG, et al. Structural organization of yeast and mammalian mediator complexes〔J〕. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000;97(26)：1430710.

　　11 Cosma MP, Panizza S, Nasmyth K. Cdk1 triggers association of RNA polymerase to cell cycle promoters only after recruitment of the mediator by SBF〔J〕. Mol Cell, 2001;7(6)：121320.