姜黄素对脓毒症大鼠肺组织高迁移率族蛋白B1水平的影响

　　作者：梁小仲　姚华国　邵义明　张媛莉　夏炎火 作者单位：516001 广东省，惠州市中心人民医院ICU(梁小仲);广东医学院附属医院ICU(姚华国、邵义明、张媛莉);温州医学院第一附属医院ICU(夏炎火)

　　【摘要】 目的　观察姜黄素对脓毒症大鼠肺组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平和120 h存活率的影响。方法　采用盲肠结扎穿孔术建立大鼠脓毒症模型。脓毒症大鼠随机分为对照组和姜黄素处理组，后者以100 mg/kg剂量盲肠结扎穿孔术(CLP)后0、12、24、36、48 h分别于腹腔注射姜黄素，观察姜黄素处理后脓毒症大鼠于CLP后3、6、12、24、48、72 h时间点肺组织HMGB1的表达水平和盲肠结扎穿孔术后120 h两组大鼠存活率的比较。结果　脓毒症大鼠经姜黄素处理后肺组织HMGB1表达水平显著降低(P<0.05)，术后120 h存活率较对照组明显增高(61% vs. 33%，P<0.05)。结论　姜黄素能够降低脓毒症大鼠肺组织HMGB1水平并提高存活率。

　　【关键词】 脓毒症;　姜黄素;　HMGB1蛋白质

　　脓毒症(sepsis)是感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，其本质是机体过度释放炎症介质导致炎症反应失控和免疫功能紊乱，极易发展为脓毒性休克(septic shock)及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。MODS救治困难，预后不良，已成为当今重症监护病房(ICU)的首要死亡原因，死亡率达40%～80%[1]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是近年发现的一种重要晚期炎症介质[2]，在内毒素、细胞因子或烧伤、感染、休克等因素的刺激下可过度分泌，参与SIRS/sepsis的发病过程，维持并延长炎症。随后，临床上对HMGB1进行了大量研究，发现脓毒症患者及脓毒症休克患者血液中HMGB1浓度显著升高[3]，HMGB1靶向治疗研究已引起广泛重视。姜黄素是一种常见中药，对人体无毒副作用且价格低廉，近年研究发现姜黄素具有抗炎作用，对肿瘤坏死因子(TNF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)均有抑制作用，我们在筛选中药抗HMGB1成分研究中发现姜黄素对肺组织HMGB1表达有明显抑制作用，现就动物实验结果报道如下。

　　一、材料和方法

　　1. 材料：SPF级成年雄性SD大鼠110只(其中14只为对照实验组、姜黄素实验组死亡后补充模型)，体重220～250 g(8～10周龄，由广东医学院动物中心提供)，姜黄素为Sigma公司产品。

　　2. 肺组织HMGB1检测：采用免疫组织化学SABC法。一抗HMG-1试剂盒(Sc-26351)为Santa Cruz Biotechnology产品;免疫组化染色试剂盒(SP-9003)、浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9031)均为北京中杉金桥生物公司产品。

　　3. 动物实验：采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备大鼠脓毒症模型，即在腹部去毛消毒后沿腹正中线做一小切口，在距盲肠末端1 cm处用7号丝线结扎盲肠，用22 G针头在盲肠上对穿3次，按生理位置还纳肠管后逐层缝合腹壁切口。脓毒症大鼠随机分为脓毒症对照组和姜黄素处理组，每组各48只;对照组随机分为对照实验组(30只)、对照生存率观察组(18只);姜黄素处理组随机分为姜黄素实验组(30只)、姜黄素生存率观察组(18只)。对照实验组、姜黄素实验组中死亡脓毒症大鼠归入相应生存率观察组中以统计生存率，死亡脓毒症大鼠由新的模型补充。姜黄素处理组以100 mg/kg剂量于CLP后0、12、24、36、48 h分别予以腹腔注射姜黄素，而脓毒症对照组予以相当剂量生理盐水腹腔注射。姜黄素实验组、对照实验组两组均在CLP后3、6、12、24、48、72 h随机活杀大鼠5只，取肺组织固定于10%甲醛中，按实验步骤制作石蜡切片后，用免疫组化SABC法检测HMGB1的表达。

　　4. 统计学分析：采用SPSS 13.0 for Windows统计软件包进行双侧t检验分析与卡方检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　二、结果

　　肺组织HMGB1表达的结果：图1为两组脓毒症大鼠肺组织的免疫组化照片，照片中褐色染色物质为HMGB1。每张切片选取褐色染色物质最多的10个高倍视野(×400)，用数字显微系统拍照，将照片输入MoticSystem 6.0软件分析系统中进行分析，测定每个高倍视野HMGB1积分光密度(IOD)值。

　　1. 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织HMGB1水平的影响(表1)：脓毒症大鼠肺组织HMGB1 水平明显升高，HMGB1表达水平在CLP后48 h达高峰，而经姜黄素处理后肺组织HMGB1 水平显著性降低，从术后12 h开始两组差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

　　2. 姜黄素对脓毒症大鼠存活率的影响(表2,3)：姜黄素实验组死亡5只大鼠纳入姜黄素生存率观察组，即23只脓毒症大鼠死亡9只，120 h生存率为61%;对照实验组死亡9只大鼠纳入对照生存率观察组，即27只脓毒症大鼠死亡18只，生存率为33%;两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，姜黄素对脓毒症大鼠有明显的保护作用。表1　姜黄素对脓毒症大鼠肺组织HMGB1水平的影响表2　4组脓毒症大鼠各时间点死亡数表3　姜黄素对脓毒症大鼠生存率的影响

　　三、讨论

　　HMGB1是一种分子量为30 kD左右的非组蛋白染色体结合蛋白，是一种“晚期”炎症介质，参与脓毒症发病过程。巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞和坏死细胞在细菌、LPS、TNF-α、IL-1刺激下均可释放HMGB1至胞外，释放到胞外的HMGB1能再次激活单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和中性粒细胞[2]，诱发IL-1、IL-8、TNF-α和MIP等多种炎症介质瀑布式释放，HMGB1在炎症因子网络中起着重要作用，在多种感染性疾病中均扮演着重要角色[4]。Wang等[5]研究证实，血浆HMGB1水平高死亡率也高，而气管内滴入或经腹腔、静脉给予纯化的重组HMGB1(rHMGB1)均能诱发脓毒症，给予大剂量rHMGB-1后可引起死亡，因此HMGB1具有独立的致死性，拮抗HMGB1的抗体则产生显著的保护作用[6-7]。我们既往的动物实验亦提示HMGB1与脓毒症严重程度及预后关系密切[8]。目前已有相关临床试验发现重度脓毒症患者血浆HMGB1水平明显高于正常对照组，且血浆HMGB1与患者器官功能障碍严重程度显著相关[9]。HMGB1靶向治疗研究引起了人们的高度关注，目前临床上尚未见有针对HMGB1的抑制/拮抗药物，而HMGB1靶向治疗的关键是研发有效的HMGB1拮抗剂。

　　目前在动物实验中发现有HMGB1拮抗作用的有正丁酸钠、丙酮酸己酯等。我国中药研究历史悠久、资源丰富，对许多疾病已取得非常明显的疗效，目前世界各国对中药的研究和应用日益重视，但目前对中药以及其有效成分的抗HMGB1作用研究甚少，曾有学者研究发现小檗碱能够明显降低脓毒症小鼠血清HMGB1水平，并提高脓毒症小鼠存活率[10]。

　　姜黄素是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术等的块茎中提取出来的一种多酚类物质，也是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分，有抗肿瘤、抗突变、抗微生物、降脂、保护肝肾、抗纤维化、提高免疫力，抗氧化、清除体内超氧离子、过氧化氢离子及一氧化氮(NO)，减少各种炎症因子的表达和分泌[11]等广泛的药理作用，而抗炎作用是近年来研究得比较多的新热点。姜黄素是一种非特异性NF-κB抑制剂[12]，NF-κB是目前脓毒症炎症因子合成研究比较明确的通路之一。细菌、LPS等有害刺激物均可活化NF-κB引起HMGB1等多种炎症因子的转录，释放到胞外的HMGB1与其相应受体如RAGE等结合后，能够引起NF-κB再次活化，导致炎症介质处于持续释放状态，使机体处于多种炎症介质持续攻击状态。已有研究指出，抑制NF-κB活化，能够降低HMGB1 mRNA的表达[13]。因此，无论是针对早期炎症因子的合成或者阻断后期晚期因子的后续损害，姜黄素均有强大的抗炎作用。与其他的抗炎治疗不同，姜黄素不是针对某一个炎症因子，它在抑制多个炎症因子如IL-1β、IL-8和TNF-α产生的同时还抑制NF-κB通路发挥其对多种下游炎症因子基因的调控[14-15]。本实验结果显示，姜黄素明显降低脓毒症大鼠肺组织HMGB1水平，并提高存活率，提示姜黄素对脓毒症大鼠的保护作用与抑制HMGB1表达有关。

　　(本文图片见光盘)

　　【参考文献】

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