痰热清对呼吸道合胞病毒感染人支气管上皮细胞分泌胸腺基质淋巴细胞生成素作用的体外研究

　　作者：蓝丹　檀卫平　陈环　吴葆菁　麦贤弟　黄花荣 作者单位：510120　广州，中山大学孙逸仙纪念医院儿科

　　【摘要】 目的　探讨痰热清对体外呼吸道合胞病毒(RSV)感染人支气管上皮细胞(NHBE)分泌胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的影响。方法　用Hep-2细胞扩增病毒，并进行毒力鉴定。建立RSV感染NHBE体外细胞模型。酶联免疫吸附(ELISA)法检测RSV感染NHBE后TSLP水平。将痰热清以不同给药方式(预防给药、直接灭活、治疗给药方式)干预RSV感染NHBE，ELISA法检测TSLP水平变化。结果　实时荧光定量RT-PCR方法鉴定细胞模型建立成功。(1)RSV对NHBE分泌TSLP的影响：相同感染时间内(12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h)，随着感染滴度增加(10 TCID50、50 TCID50、100 TCID50、500 TCID50、1000 TCID50)，各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势，与正常细胞对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。相同感染滴度内(10 TCID50、50 TCID50、100 TCID50、500 TCID50、1000 TCID50)，随着感染时间增加(24 h、48 h、72 h、96 h、120 h)，各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势，与12 h组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。(2)痰热清对RSV感染NHBE分泌TSLP的影响：在12 h、24 h、48 h、72 h给药时间内，痰热清、利巴韦林的不同给药方式与病毒对照组比较，均下调TSLP水平(P<0.05)，以预防给药方式最为明显。预防给药方式下，痰热清组较利巴韦林组下调TSLP的作用更明显(P<0.05)。结论　RSV能诱导NHBE分泌TSLP，痰热清可抑制RSV引起的TSLP分泌增加，以预防方式给药明显，痰热清可在病毒感染的控制中起到重要作用。

　　【关键词】 呼吸道合胞病毒;　上皮细胞;　支气管;　胸腺基质淋巴细胞生成素;　痰热清

　　【Abstract】　Objective　To study effects of traditional Chinese medicine Tanreqing injection on the secretion of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) in human bronchial epithelial cell infected by respiratory syncytial virus (RSV) in vitro.Methods　1.Hep-2 cell lines were cultured in vitro and infected by RSV.Then the infectious titer of RSV was determined by TCID50 technique.We established a model of NHBE infected by RSV.2.NHBE were infected with series RSV titers and in series incubated hours.The level of TSLP in the culture supernatants was determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).3.The effect of Tanreqing treatment on TSLP secretion was based on cell culture in vitro.The level of TSLP in three types of drug delivery(including precaution，direct deactivation and therapy) were determined by ELISA.Results　1.The mRNA of RSV was detected in total RNA of NHBE infected by RSV with QPCR method，which demonstrated that a model of RSV infection in vitro was established succesfully.2.The level of TSLP in NHBE cells supernatants infected by RSV significantly increased，compared with non-RSV.In the same postinoculation (12,24,48,72,96,120 h)，TSLP level increased obviously with raised RSV titers，compared with NHBE group(P<0.05).According to the same RSV titer(10,50,100,500,1000 TCID50)，TSLP level increased statistically in series infection time，compared with 12 h group(P<0.05).3.The TSLP level of NHBE-RSV+Tanreqing group and NHBE-RSV+Ribavirin group were evidently lower than NHBE-RSV group in all detected point(12,24,48,72 h)and in all drug delivery ways(P<0.05)，especially in precaution way.TSLP level of NHBE-Tanreqing group are depressed than NHBE-Ribavirin group by precaution(P<0.05).Conclusions　1.TSLP secretion induced by RSV infection obviously increased which was related with raiseded RSV titer and infected duration.2.Tanreqing injection inhibited TSLP secretion observably in NHBE infected by RSV with a positive time-effect relation.The inhibitory effect of precaution group was most significant among three drug delivery ways.The Tanreqing injection has a notable role in treating for the viral diseases.

　　【Key words】　Respiratory syncytial viruses;　Epithelial cells;　Bronchi;　Thymic stromal lymphopoietin;　Tanreqing

　　呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起婴幼儿呼吸道感染最重要的病原体，可在急性期引起毛细支气管炎或肺炎，并与支气管哮喘密切相关[1-3]。迄今为止，RSV感染引起喘息的机制尚未清楚，亦无安全有效的干预药物。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是近年发现的新型细胞因子，作为病毒感染与哮喘之间的桥梁备受国内外关注[4]。我国传统中药在抗病毒治疗方面，与利巴韦林相比，不仅副作用小，且具有快速解热、化痰等功效，但药效机制不明。痰热清注射液在临床上应用对呼吸道感染疗效肯定[5-6]，但目前尚未见痰热清详细抗病毒机制探讨的研究报道。本文通过建立RSV感染人支气管上皮细胞(normal human bronchial epithelium，NHBE)的体外细胞模型，观察RSV感染NHBE分泌TSLP的变化，以及痰热清的不同给药方式对体外RSV感染NHBE释放TSLP的影响，探讨痰热清作用特点，为阐明其抗病毒机制提供依据，为早期有效防治儿童哮喘提供新的治疗手段。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1. 实验用药：痰热清注射液(上海凯宝药业股份有限公司产品，批号100112;规格为每支10 ml，生药重量为每支3.35 g，浓度为335 g/L);阳性对照药物：利巴韦林注射液(河南天方药业股份有限公司产品，批号090930250;规格为每支1 ml，生药重量为每支100 mg，浓度为100 g/L)。

　　2. 细胞：NHBE由广东省人民医院肺癌研究所提供，生长液为含10%胎牛血清的MEM液(美国Gibco公司)，维持液为含2%胎牛血清的MEM液。人喉癌上皮细胞(Hep-2)由广州市儿童医院中心实验室提供，生长液为含10%胎牛血清的DMEM液(美国Gibco公司)，维持液为2%胎牛血清的DMEM液。

　　3. 病毒：RSV为标准株Long株(A亚型)，购自广州博特生物工程责任有限公司。

　　4. 试剂与仪器：Trizol提取试剂(Invitrogen公司)，Realtime one step PCR 试剂盒(日本Takara公司)，Taqman探针、RSV A亚型N基因引物(上海生工生物工程有限公司合成)，RSV A亚型N基因重组质粒(广州呼吸疾病研究所提供)，TSLP ELISA试剂盒(武汉华美科技有限公司)。ABI 7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，酶标仪TECAN TYPE：Sunrise Remote/TonchScreen(南京华东公司)。

　　二、方法

　　1. Hep-2细胞、NHBE细胞培养：Hep-2细胞、NHBE细胞培养分别采用含10%胎牛血清的DMEM、MEM培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。镜下观察细胞长至70%～80%融合时进行传代。所有实验均采用对数生长期细胞。

　　2. RSV培养及病毒毒力测定：将Hep-2细胞接种于25 cm2培养瓶中，待细胞长至70%～80%融合，弃去生长液，接种病毒液，33 ℃吸附1～2 h后弃去病毒液，加入维持液继续培养3～5 d。待细胞60%～70%产生病变后，收获病毒，置于-80 ℃和37 ℃反复冻融2～3次，移入离心管，4 ℃、1000 r/min(离心半径6.5 cm)离心10 min，收集病毒上清，分装后于-80 ℃冻存备用。将Hep-2细胞接种于96孔板，采用组织培养半数感染量(TCID50)法测定病毒滴度，用Reed-muench公式[7]计算结果。

　　3. RSV感染NHBE体外模型的建立及鉴定：将NHBE以2×105/ml接种于6孔板，每孔培养体积2 ml，待细胞长至80%融合，按每孔100 TCID50接种病毒液(正常细胞对照组加相同体积的维持液)，吸附2 h，弃去病毒液，PBS液冲洗3次，加入维持液继续培养72 h。用Trizol提取细胞总RNA(参照Trizol 说明书进行)，采用实时荧光定量RT-PCR法检测细胞中RSV核酸基因(参照Takara One Step Prime Script RT-PCR Kit说明书进行)。上游引物：5′-AGGATTGTTTATGAATGCCTATGGT-3′;下游引物：5′-GCTTTTGGGTTGTTCAATATATGGTAG-3′;荧光探针：5′-FAM-TCATCCAGCAAAT(TAMRA)ACACCATCCAACG-P-3′。

　　4. RSV对NHBE分泌TSLP的影响：将NHBE以2×105/ml接种于6孔板，每孔培养体积2 ml，待细胞长至80%融合，弃去培养液，PBS液冲洗2次。

　　实验分NHBE组(正常细胞对照组)和RSV感染组，感染组加入不同感染滴度的病毒，以1000 TCID50、500 TCID50、100 TCID50、50 TCID50、10 TCID50为分为5个组，各组设3个复孔。

　　感染组加入RSV病毒液后，置33 ℃吸附2 h后，弃去病毒液，PBS液冲洗3次，加入维持液继续培养。感染12 h、 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h收集细胞上清。上清在4 ℃、3000 r/min(离心半径6.5 cm)离心15 min转至干净EP管中-80 ℃冻存，待测 TSLP。TSLP检测采用ELISA法(参照试剂盒操作说明书进行)。

　　5. 痰热清对RSV感染NHBE合成TSLP的影响：(1)药物毒性测定：将NHBE以1×104/ml接种于96孔板，每孔200 μl，待细胞长至80%融合，用维持液连续倍比稀释10个浓度(1∶10,1∶20，1∶40，1∶80，1∶160,1∶320,1∶640,1∶1280,1∶2560，1∶5120)的痰热清、利巴韦林注射液，以每孔200 μl加入培养板，每个稀释度4孔，同时设正常细胞对照孔。37 ℃、5% CO2培养，每天置显微镜下观察细胞形态，连续5 d，记录细胞病变结果，以不出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的药物最小稀释倍数为药物的无毒性稀释度。

　　痰热清：见表1，稀释至320倍(即1.05 g/L)后细胞形态不发生改变，对传代细胞生长没有影响，本研究将此稀释度定为痰热清的无毒性稀释度。

　　利巴韦林：见表2，稀释至160倍(即0.625 g/L)后细胞形态不发生改变，对传代细胞生长没有影响，本研究将此稀释度定为利巴韦林的无毒性稀释度。

　　(2)痰热清对RSV感染NHBE后合成TSLP的影响：将NHBE以1×104/ml接种于96孔板，每孔200 μl，待细胞长至80%融合。根据上步试验确定药物浓度，痰热清为1.05 g/L(1∶320稀释)，利巴韦林为0.625 g/L(1∶160稀释)，每个药物浓度设3孔细胞。病毒攻击量为100 TCID50。

　　实验分3组：(1)预防方式给药组：病毒感染细胞前24 h给药;(2)直接灭活病毒组：药液与病毒液混合，置4 ℃作用24 h后，加入细胞层;(3)治疗方式给药组：病毒感染细胞2 h后给药。设正常细胞对照组和病毒对照组，实验重复3次。

　　给药12 h、24 h、48 h、72 h后收集细胞上清。上清在4 ℃、3000 r/min离心15 min转至干净EP管中-80 ℃冻存，待测TSLP。

　　三、统计学分析

　　所有数据用均数±标准差(x-±s)表示，多组均数比较采用方差分析或秩和检验;P<0.05为差异有统计学意义。所有数据统计分析均使用SPSS 11.5软件。

　　结　　果

　　一、RSV感染NHBE体外模型的建立

　　RSV接种于NHBE后，光学显微镜下观察CPE，表现为细胞胞体增大，透亮度降低，小部分细胞呈坏死聚集状，逐渐形成拉网状。100 TCID50的RSV感染72 h后引起NHBE形态学改变，但与正常细胞对照组比较，大部分细胞形态仍正常，仅小部分细胞破碎死亡，提示感染滴度为100 TCID50和感染时间为72 h是RSV感染NHBE的最佳实验条件。RSV以100 TCID50接种NHBE后，继续培养72 h(图1)，应用荧光定量RT-PCR法(探针法)从NHBE提取的总RNA中扩增出RSV病毒核酸基因，证实RSV成功感染NHBE。

　　二、RSV对NHBE合成TSLP的影响

　　不同感染滴度的RSV接种NHBE后，TSLP水平均于48～72 h开始明显上升，96～120 h达峰值(表3)。其中NHBE-RSV(1000)组接种后120 h TSLP分泌水平最高，为(530.69±1.18) pg/ml，高于接种后12 h[(120.12±1.80)pg/ml]、24 h[(140.33±2.12)pg/ml]、48 h[(150.73±1.55)pg/ml]、72 h[(347.99±1.53)pg/ml]和96 h[(440.95±1.23)pg/ml](P均<0.05)。

　　相同感染时间内，随着感染滴度的增加，TSLP分泌水平均呈上升趋势，与正常细胞对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。相同感染滴度内，随着感染时间的增加，TSLP分泌水平均呈上升趋势，与12 h组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

　　三、痰热清对RSV感染NHBE合成TSLP的影响

　　根据药物毒性测定结果，痰热清、利巴韦林分别在1∶320、1∶160体积以上稀释对NHBE无毒性作用，定为该药的无毒性稀释度。基础状态下正常支气管上皮细胞均能分泌一定量的TSLP(表4)，在RSV感染作用下NHBE合成的TSLP水平高于正常细胞对照组(P<0.05)。在相同的作用时间内，痰热清、利巴韦林以不同的给药方式干预(预防给药、直接灭活、治疗给药)均能降低RSV感染NHBE合成的TSLP水平，与病毒对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，并以预防给药方式下调TSLP的作用最为明显。

　　痰热清组与利巴韦林组比较，预防给药方式下12 h、24 h、48 h时，痰热清下调TSLP的作用更明显(P<0.05);直接灭活给药方式下12 h时，痰热清下调TSLP的作用更明显(P<0.05);治疗给药方式下24 h时，痰热清下调TSLP的作用更明显(P<0.05)。表1　不同稀释浓度的痰热清对细胞的作用表2　不同稀释浓度的利巴韦林对细胞的作用表3　病毒滴度与感染时间对RSV诱导NHBE分泌TSLP水平影响表4　不同给药方式的痰热清、利巴韦林对RSV感染NHBE分泌TSLP水平的影响

　　讨　　论

　　RSV下呼吸道感染(RSV-lower respiratory tract infection，RSV-LRTI)是诱发婴幼儿第1次喘息并导致婴幼儿住院的最常见原因。流行病学调查发现，患过RSV毛细支气管炎的婴幼儿50%～70%可反复喘息，甚至发展成哮喘[8]。目前常用的平喘药物对RSV性急性喘息未被证实有明确的临床疗效[9-10]。传统上常全身使用的糖皮质激素亦被部分随机、双盲、安慰剂对照研究提出质疑[11]，疗效欠佳可能与其无法有效抑制RSV感染诱导释放的某些细胞因子及炎症介质有关。TSLP是近年发现的新型细胞因子，主要来源于胸腺基质细胞和上皮细胞，特别是经抗原激活的NHBE。Ying等[12]对哮喘患者进行支气管活检，应用PCR方法检测NHBE、黏膜下层细胞均有TSLP mRNA表达，且显著高于正常对照组，其他学者也证实NHBE可产生TSLP[13-14]。病毒感染后，NHBE可能通过分泌TSLP促进炎症性树突细胞的生成，增加炎症气道浸润[4,15-16]。提示TSLP可能是引起RSV性急性喘息的重要炎症介质。本研究用RSV感染NHBE株，结果显示合成TSLP水平随感染时间的延长而逐渐增高，在72～120 h增高明显;并随着病毒感染滴度的提高而逐渐增高，进一步证实RSV感染诱导NHBE合成TSLP水平增高可能是其引起RSV性急性喘息的分子生物学机制之一。

　　目前对于RSV感染引起的严重毛细支气管炎尚无安全特效的治疗药物。利巴韦林由于毒性较大在临床应用上受到极大限制。RSV免疫球蛋白由于费用昂贵和血制品安全问题，无法推广。因此国内外都在积极寻找防治RSV感染的有效药物。痰热清注射液是国家二类新药，作为复方中草药注射剂，由熊胆粉、山羊角、金银花、黄芩、连翘五味中药提取而成，熊胆粉有解痉、抑菌及抗炎作用;山羊角含有氨基酸，有显著的免疫调节、退热及镇静作用;金银花含有抑菌成分绿原酸和异绿原酸，可减轻肺泡炎性渗出，阻止急性肺泡上皮炎性损伤，缩小肺泡渗出范围，降低内毒素血症炎性细胞因子的表达，并可抑制中枢发热介质释放，阻抑免疫细胞的超敏反应过程。在临床上治疗呼吸道感染效果卓著[5]。利巴韦林是国内外公认的抗病毒药物，本研究将其作为抗RSV感染的阳性对照，结果表明，痰热清组、利巴韦林组与病毒对照组比较，均能降低RSV感染NHBE合成TSLP的水平，且具有统计学意义，说明痰热清、利巴韦林在体外对RSV感染NHBE分泌TSLP起抑制作用，可能进一步阻断其与树突状细胞“对话”，下调炎症因子的表达与炎症细胞的浸润。结果还表明不论是预防方式给药，还是直接灭活方式或治疗方式给药，痰热清组、利巴韦林组与病毒对照组比较，TSLP分泌水平均下降，且具有统计学意义，说明痰热清既可直接杀灭RSV，还可抑制病毒吸附，起到保护细胞免受RSV攻击的作用，同时能部分抑制已经进入细胞内的病毒进行增殖。但痰热清抗RSV感染的详细机制仍有待深入研究。本研究还发现，痰热清预防方式给药对RSV感染NHBE下调TSLP分泌水平的作用较直接灭活方式和治疗方式给药明显。预防给药组与直接灭活组、治疗给药组比较，TSLP分泌水平下降具有统计学意义，说明痰热清所含多种有效药物成分抑制RSV吸附、穿透细胞的作用更明显，而对于已进入细胞内的病毒抑制作用较弱。

　　综上所述，RSV能诱导NHBE分泌TSLP，痰热清可抑制RSV引起的TSLP分泌，预防方式给药明显，为进一步控制病毒感染及防治哮喘提供了新方法。

　　(本文图片见光盘)

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