吸入糖皮质激素对哮喘急性发作患儿血浆血小板活化因子水平的影响

　　作者：吕剑平,吕进泉,唐燕,忻悦,张晓鸣　　作者单位：江苏大学附属医院，江苏 镇江

　　【摘要】目的：通过对吸入糖皮质激素治疗前后哮喘患儿血浆血小板活化因子(PAF)水平的变化的观察，进一步探讨其临床意义。方法：采用生物学检测法，检测哮喘急性发作期患儿血浆PAF浓度及吸入糖皮质激素治疗后血浆PAF浓度，并以同期体检健康儿童24例作为对照。结果：哮喘急性发作期患儿血浆PAF浓度吸入糖皮质激素治疗前较治疗后明显增高，差异有显著性(t=2.458, P<0.05)，经吸入糖皮质激素治疗后患儿血浆PAF浓度降至正常水平，与对照组比较差异无显著性(t=1.527, P>0.05)。结论：PAF作为一种重要的继发性炎性介质，其生成和释放参与了哮喘患儿气道慢性炎症、高反应性和可逆性阻塞的形成。糖皮质激素抑制了磷脂酶A2的活性，从而抑制了PAF的生成与释放。

　　【关键词】 糖皮质激素,哮喘,血小板活化因子

　　哮喘是一种由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)作为一种重要的炎性介质，其生成和释放参与了哮喘患儿气道慢性炎症、高反应性和可逆性阻塞的形成。本研究通过对吸入糖皮质激素治疗前后哮喘患儿血浆PAF水平变化的观察，进一步探讨其临床意义。现报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　哮喘组：2007-01～2008-01在江苏大学附属医院小儿哮喘病防治中心治疗的哮喘急性发作期患儿36例，诊断符合“儿童支气管哮喘防治常规”的诊断标准[1];病情严重程度均为三级(中度持续)。男19例，女17例，年龄1～12岁，平均(6.5±0.4)岁。入选前6周内未使用糖皮质激素及其他抗过敏药物、免疫调节药物，入选后体检血常规、肝肾功能正常。 对照组：同期体检健康儿童24例，其中男14例，女10例，年龄1～12岁，平均(7.0±0.6)岁，经体检排除心、肺、肝、肾、血液系统及其他过敏性疾病。 组间资料比较：各组间性别、年龄构成比均无显著差异(P>0.05)。哮喘治疗经过：全部病例采用空气压缩泵予以丁地去炎松(布地奈德)1～2mg/d雾化吸入;2周后改布地奈德400μg/d吸入，同时予以β受体激动剂特布他林对症治疗至症状缓解。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 标本的搜集

　　哮喘组36例于治疗前和治疗6周后分别抽血2mL，对照组24例抽血2mL送检。

　　1.2.2 检测原理

　　采用生物学检测法[2]。首先经氯仿和甲醇提取被检血浆PAF，然后用薄层层析的方法，将已知标准品PAF(美国Sigma公司)作对照，纯化出被检血浆的PAF。利用PAF能促进兔血小板聚集反应的原理，用血小板聚集仪测定已知不同浓度的标准品PAF对兔血小板的最大聚集率，分别以标准品PAF浓度和血小板最大聚集率为横坐标和纵坐标，得PAF诱导兔血小板聚集反应的标准曲线。用同样方法测定纯化PAF标本对兔血小板的最大聚集率，再根据标准曲线换算成相应的血浆浓度。

　　1.2.3 检测方法

　　1.2.3.1 提取血浆标本中的PAF

　　枸橼酸钠0.2mL加血1.81mL，3000r/min离心5min，取富血小板血浆0.5mL，加氯仿2mL、甲醇4mL，充分振荡;再加入蒸馏水2mL、氯仿2mL，再次振荡;取氯仿层，用氮气吹干;-20℃保存备用。

　　1.2.3.2 纯化血浆标本中的PAF

　　①制硅胶板：取硅胶1.5g置于研钵中，加蒸馏水5mL，研匀后迅速浇在8cm×12cm 的干板上，水平放置，待凝固后置65℃烤箱烘15min，再放105℃烤箱烘15min后备用(用前配制)。②点样：标准品PAF用氯仿溶解(1.2mg/mL氯仿)，提取的样品PAF加25~50μL(A值)的BSA-PSB液溶解，分别用微量进样器吸取标准PAF(作对照)及已经提取的被检血浆各10μL，在层析板一端2cm处点样。③层析：先用展开剂，氯仿:甲醇:水=65:35:6放入层析缺中，饱和2h，液层高度约为1cm左右，将点样后的薄层板放入缸中(薄层板与展开剂液面倾角为30度左右)。④显色：将薄层板取出后凉干，置碘蒸气缸中显色，出现清晰的黄色斑点即止。⑤再提取：根据标准PAF的迁移率，将被检标本显色的相应区域刮下，重新提取，取氯仿层用氮气吹干，加入BSA-PSB液300～600μL(B值)备用。

　　1.2.3.3 兔血小板悬液制备

　　取大白兔心脏血10mL，1000r/min离心5min，制备富血小板悬液，血小板悬液经洗涤液洗涤2～3次，用BSA-PSB液配制，调节血小板浓度为300～400×109/L。

　　1.2.3.4 PAF标准曲线绘制

　　标准PAF用BSA-PSB液作为系列浓度(0.5μg/L、1.0μg/L、1.5μg/L、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L、10μg/L、12μg/L、14μg/L、16μg/L)，分别取各浓度PAF标准品及兔血小板悬液各250μL加入测定板中，用全自动血小板聚集仪诱导兔血小板聚集反应，联机电脑以血小板最大凝集率为纵坐标，PAF浓度为横坐标，得PAF诱导兔血小板聚集反应的标准曲线。

　　1.2.3.5 血浆PAF含量测定

　　取上述制备的被检血浆纯化PAF标本(病人和对照)和兔血小板悬液各250μL，加入测定板中，测定兔血小板的最大聚集率。将A值与B值输入电脑，数据处理软件根据标准曲线将被检血浆标本中PAF的含量换算成相应的血浆浓度，如果被检血浆标本PAF浓度超过线性范围，则将标本作适当稀释，使其诱导的血小板最大凝集率全部位于线性范围内。

　　1.2.4 统计学处理

　　结果以均数±标准差(x±s)表示,以方差分析及两两比较作统计学处理。

　　2 结果

　　哮喘急性发作期患儿血浆PAF浓度在吸入糖皮质激素治疗后较治疗前明显降低，差异有显著性(t=2.458,P<0.05);经吸入糖皮质激素治疗后患儿血浆PAF浓度降至正常水平，与对照组比较差异无显著性(t=1.527,P>0.05)。

　　3 讨论

　　PAF是在磷脂酶A2的作用下由B淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞、血小板等炎症细胞合成的一种磷脂类化合物，是导致哮喘发病的继发性炎症介质;PAF参与哮喘气道慢性炎症、高反应性和可逆性阻塞的形成[3]。研究证实哮喘动物的支气管肺泡灌洗液中PAF明显增高[4]，PAF参与哮喘的可能机制为[5]：①趋化和激活炎症细胞：PAF可激活多种炎症细胞并趋向炎症区域浸润，从而促发组织的炎症反应，并导致炎症细胞释放白三烯(LTs)、6-酮-前列腺环素F(6-K-PGF1)等炎症介质。②气道平滑肌收缩：PAF可诱发速发相支气管痉挛，作用时间可持续长达1～2h。③血管效应：PAF可以诱发肺、皮肤、小肠、鼻粘膜等组织的微血管收缩，需要LTs参与。并可能通过血管内皮细胞的PAF受体引起血管通透性增加。④气道粘液栓形成：PAF可以直接或通过嗜酸性粒细胞使气道上皮破坏、脱落，粘膜纤毛功能受损，增加气道粘液分泌，并通过血浆蛋白外渗而使气道分泌物中蛋白含量增加，导致小气道中粘液栓形成。

　　糖皮质激素是目前最有效的抗炎症药物，其作用机理尚未完全清楚。本研究发现哮喘急性发作期患儿血浆PAF浓度增高，经吸入糖皮质激素治疗后血浆PAF浓度明显降低，其机制可能为：糖皮质激素通过调节T辅助细胞亚群，抑制炎症细胞迁移与活化等炎症反应过程[6, 7]，同时也抑制了磷脂酶A2的活性，从而抑制了PAF的生成与释放。

　　【参考文献】

　　[1]中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童支气管哮喘防治常规[J].中华儿科杂志,2004,42(2):100106

　　[2]许文龙,曹红翠,胡嘉波,等.血浆溶血血小板活化因子的测定及临床意义[J].中国实验诊断学,1997,1(1):35

　　[3]Kasperska-Zajac A,Brzoza Z,Rogala B.Platelet activating factor as a mediator and therapeutic approach in bronchial asthma[J].Inflammation,2008,31(2):112120

　　[4]Salluh JI, Pino AV, Silva AR, et al. Lung production of platelet-activating factor acetylhydrolase in oleic acid-induced acute lung injury[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,2007,77(1):18

　　[5]吕进泉.血小板活化因子与哮喘[J].江苏大学学报(医学版), 2003,13(3):266

　　[6]吕剑平,顾兆坤,吕进泉.糖皮质激素对哮喘患儿T辅助细胞亚群功能失衡的影响 [J].江苏医学,2002,28(8):616

　　[7]Wu K,Goyal N,Stark JG,et al.Evaluation of the administration time effect on the cumulative cortisol suppression and cumulative lymphocytes suppression for once-daily inhaled corticosteroids:a population modeling/simulation approach [J].J Clin Pharmacol,2008,48(9):10691080