慢性阻塞性肺病中AQP4 mRNA的表达变化及与气道炎症的相关研究

　　者：朱柏,杨岚,陈天君　　作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院呼吸内科，陕西西安

　　【摘要】目的 探讨水通道4(apuaporin 4, AQP4)mRNA在慢性阻塞性肺病(COPD)的表达及对气道慢性炎症的影响和意义。方法 选取因各种原因行支气管镜检查被病理学家证实为正常支气管黏膜者及慢性阻塞性肺病患者各30例，分别为正常组及COPD组。测试肺功能，并行支气管镜检，所取黏膜标本用逆转录PCR法检测mRNA表达，HE染色观察支气管黏膜炎症细胞浸润程度。结果 与正常对照组相比较，COPD组患者支气管黏膜AQP4 mRNA表达减少(P<0.05)，并和炎症程度负相关(r=-0.493，P<0.01)，与FEV1/FVC、FEV1/pred%呈正相关(r分别为0.405、0.461，P均<0.01)。结论 COPD患者水通道mRNA表达减低，将影响气道湿化功能，加重气道炎症，促使COPD发生发展。

　　【关键词】 慢性阻塞性肺病,水通道,气道炎症

　　ABSTRACT: Objective To explore the effect and significance of AQP4 mRNA expression in bronchial epithelium of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) on airway inflammation. Methods Bronchial epithelium was obtained by bronchoscopy in patients with COPD (n=30) and healthy controls (n=30) whose bronchial epithelium was confirmed to be normal by the pathologist. AQP4 mRNA were studied by RTPCR method. Inflammatory cells infiltration was observed by HE staining; pulmonary function test was performed too before bronchoscopy. Results Compared with that in the healthy controls, AQP4 mRNA expression in COPD was reduced (P<0.05). Furthermore, AQP4 mRNA expression was correlated negatively with the inflammation of bronchial epithelium (r=-0.493, P<0.01), and correlated positively with FEV1/FVC, FEV1/pred% (r was 0.405 and 0.461 respectively, P<0.01). Conclusion The reduced expression of AQP4 mRNA in bronchial epithelium of patients with COPD reduced the airway humidification, aggravated the airway inflammation, and contributed to the development of COPD.

　　KEY WORDS: chronic obstructive pulmonary disease; aquaporin; airway inflammation

　　气道水转运特性对于吸入气体的湿化和维持气道表面液层的容积和组成具有重要作用，气道表面液层的容积和组成异常在一些气道疾病如哮喘和支气管炎的发病中起重要作用。本研究检测了水通道4(aquaporin, AQP4)mRNA在慢性阻塞性肺病患者和正常支气管对照者的支气管黏膜中的表达，以探讨AQP4与气道慢性炎症的关系及在COPD发病中的作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　正常对照组选取因各种原因行支气管镜检查被病理学家证实为正常支气管黏膜者，共30例，年龄25-73岁，平均(53.33±11.51)岁。其中男性18例，女性12例。慢性阻塞性肺疾病组(COPD组)选取符合中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病学组颁布的慢性阻塞性肺疾病的诊治指南标准的COPD患者30例，年龄35-71岁，平均(55.93±12.31)岁。其中男性20例，女性10例。两组资料在年龄及性别上无显著性差异(P>0.05)，具有可比性。以上两组均不包括合并其他严重心肺疾病不能耐受气管镜检查者及合并呼吸衰竭者。

　　1.2 试剂

　　Trizol试剂购于美国sigma公司，RTPCR试剂盒、DEPC购于北京鼎国生物技术有限责任公司，DNA marker购于北京赛百盛基因技术有限公司，AQP4引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

　　1.3 标本收集

　　各组在10g/L的卡因表面麻醉及20g/L利多卡因环甲膜穿刺麻醉后行气管镜检，钳取黏膜后一部分放于10%(体积分数)甲醛中固定，一部分放在DEPC水处理过的冻存管中，置入冰壶内运送，1h之内放在液氮中保存。

　　1.4 方法

　　1.4.1 肺功能检查

　　各组在平静休息5-10min后，使用德国耶格公司JAEGER肺功仪作肺功能检查，主要测量用力呼气肺活量(FVC)、1s用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1/pred%)、1s用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)等指标。

　　1.4.2 形态学观察

　　组织块经10%(体积分数)甲醛固定后，酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，切片厚度5μm，HE染色，显微镜下观察。

　　1.4.3 逆转录

　　聚合酶链反应(RTPCR)检测AQP4 mRNA表达 Trizol试剂提取支气管黏膜总RNA。分光光度计测定提取的RNA浓度。取4μg总RNA进行扩增，AQP4上游引物：5′GGAATCCTCTATCTGGTCACA3′ 50pmol，下游引物：5′TGTTTGCTGGGCAGCTTTGCT3′ 50pmol，内参βactin上游引物：5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游5′CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸45s，扩增30轮，72℃延伸加时5min。将产物在20g/L琼脂糖凝胶中电泳，扩增产物片段分别是AQP4 429bp，βactin 540bp。用图像分析系统进行定量分析。

　　1.5 结果判定

　　HE染色：炎性细胞散在分布(+)，局灶性分布()，弥漫分布()。PCR产物量的计算：DNA含量=(待测标本A-背景A)/(阴性对照A-背景A)

　　1.6 统计学处理

　　所有数值资料均以均数士标准差(±s)表示。所有数据均使用SPSS 13.0统计软件处理。α=0.05为检验水准。正常组和COPD组的AQP4 mRNA表达分析用t检验，AQP4 mRNA表达与炎症程度、肺功能的关系用spearman计算相关系数。

　　2 结 果

　　2.1 正常对照组和COPD组AQP4 mRNA的表达

　　COPD组AQP4 mRNA相对表达量为0.79±0.52，正常对照组AQP4 mRNA相对表达量为1.28±0.61，两组差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

　　2.2 AQP4 mRNA表达与炎症程度相关性

　　COPD患者支气管黏膜炎症细胞浸润情况见图2。AQP4 mRNA表达与炎症程度成负相关，rs=-0.493(P<0.01)，说明AQP4 mRNA表达上调时，炎症程度减轻，AQP4 mRNA表达下调时，支气管黏膜炎症加重。

　　2.3 AQP4 mRNA表达与肺功能相关性

　　AQP4 mRNA表达和FEV1/FVC呈正相关，相关系数rs=0.405(P<0.01，图1)。AQP4 mRNA表达和FEV1/pred%呈正相关，相关系数rs=0.461(P<0.01)。说明水通道mRNA表达下调，病情越重，肺功越差。

　　3 讨 论

　　COPD是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD的发病机制尚不十分明了，目前认为气道炎症、蛋白酶抗蛋白酶失衡及氧化应激机制参与了COPD的发生发展。有研究表明气道表面液体的容积和组成[13]及气道的湿化[48]在气道炎症和COPD的发病中起重要作用。气道的水转运特性对于吸入气体的湿化和维持气道表面液体的容积和组成具有重要作用。

　　水通道蛋白是一组与水通透有关的介导水跨膜转运的细胞膜转运蛋白[910]，它广泛存在于生物组织的内皮细胞和表皮细胞膜上。目前在哺乳动物体内发现的水通道有13种，在肺组织中分布的水通道至少有4种。AQP1蛋白分布在气道和肺泡的微血管内皮、微血管和脏层、壁层胸膜的间皮细胞，AQP3位于大气道和鼻咽基底上皮的基底外侧膜。有一个研究报道了AQP3在人的小气道上皮有表达。AQP4在鼻咽、气管支气管上皮的纤毛柱状上皮细胞基底外侧膜表达，AQP5在I型肺泡上皮的顶膜及黏膜下腺上皮细胞的顶膜表达。其功能主要是维持肺泡腔内相对干燥的环境和呼吸道黏膜适当的湿润度，调节气道表面液体的容积和组成。对肺部水通道亚细胞的分布及功能进行研究的结果显示肺泡水的转运、气道表面液体的调整、气道湿化及鼻咽部分泌物的产生与水通道蛋白功能协调有关[1112]。Widdicombe[13]在研究中发现AQP4在气道(气管、鼻咽、鼻甲)表面纤毛柱状上皮的基侧膜及纤毛的出现使细胞表面水通透性增高，Song等[14]在实验中证实敲除AQP4后肺毛细血管水的渗透性显著降低,并在以后的研究中对小鼠气管切开给予机械通气吸入干燥气体测量上下呼吸道湿化功能发现，与野生型小鼠相比，AQP4/AQP3敲除后下呼吸道湿化作用变化小却显著，气道湿度减少2%-5%，上呼吸道湿化作用减少3%-9%[15]。这些研究都表明AQP4参与了气道表面液体的调节及气道的湿化。

　　本研究结果显示，在COPD组AQP4 mRNA相对表达量为0.79±0.52，正常对照组AQP4 mRNA相对表达量为1.28±0.61，两组有统计学差异(P<0.05);AQP4 mRNA表达与炎症程度成负相关，rs=-0.493(P<0.01)，说明AQP4 mRNA表达上调时，炎症程度减轻，AQP4 mRNA表达下调时，支气管黏膜炎症加重。本研究结果发现AQP4 mRNA表达和FEV1/FVC及FEV1/pred%呈正相关，相关系数r为0.405和0.461(P<0.01)。说明水通道4 mRNA表达下调，加重气道炎症，使患者的肺功能进一步恶化，加重COPD的发生发展。

　　气道水转运特性对于吸入气体的湿化和维持气道表面液体的容积和组成具有重要作用。Widdicombe[16]在研究中发现慢性支气管炎等气道炎性疾病气道黏液的积聚，反映了水分泌和黏液分泌的平衡发生了变化，黏液增多水减少导致黏性分泌物过多，不易被纤毛移动而积聚。

　　Smith[17]在研究囊性纤维化时发现气道表面液体NaCl浓度升高，上皮细胞分泌的许多内源性的抗生素在稀释液体中比浓缩溶液中杀菌效能更高。细菌易于在气道上皮定居和繁殖,而降低表面液体的渗透压即可逆转。许多研究已经证实气道湿度减低可导致显著的上皮损害和局部的炎症，纤毛广泛脱失，上皮脱落，上皮下血管渗漏、水肿，炎性细胞浸润，炎性介质、白三烯、血栓素、前列腺素(PGF2α、PGE2)释放，支气管收缩，气道阻力增加。同时气道湿度减低，可导致黏液生成减少，纤毛摆动功能进行性破坏，而病变部位产生的稠厚黏液进一步阻碍气流的湿化，使黏膜功能障碍进行性发展。本研究也证实AQP4 mRNA表达减少，会使气道炎症加重，促使COPD恶化发展。

　　综上所述，水通道表达减低，使气道湿化功能减低，并影响气道表面液体的调节，使气道炎症加重，促进COPD的发生发展。

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