寡核苷酸靶向阻断STAT6治疗哮喘的研究进展

　　作者：邓俊,周雨　　作者单位： 四川，泸州医学院附属医院呼吸内科

　　【关键词】 支气管哮喘,信号传导和转录激活因子6,反义寡核苷酸;转录因子;圈套寡核苷酸

　　支气管哮喘(Asthma，Bronchial asthma，简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞(EOS)浸润为主，伴多种炎症介质(包括相关细胞因子，趋化因子等)异常表达的气道炎症和气道高反应性疾病。哮喘气道炎症的机制复杂，近年来细胞信号传导途径对哮喘作用的研究越来越受到重视。其中，信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription ，STAT)成为近年哮喘研究的热点。STAT6作为信号转导和转录激活因子家族的一员，在Th2型细胞分化，B细胞的成熟，嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)等趋化因子激活及免疫球蛋白同种型转换等方面起着重要的作用，是变态反应性哮喘病理生理过程中重要的转录因子。STAT6基因是哮喘发病机制中一个重要的候选基因[1]。大量研究表明若能阻断STAT6信号传导系统则能减轻甚至消除哮喘气道过敏炎性反应，从而达到治疗哮喘的目的。近年来，随着分子生物学及分子免疫学等学科的发展，对哮喘目的基因的研究成为了哮喘防治研究中的重点，而寡核苷酸疗法更是成为了其中的热点。以STAT6为靶点，利用此技术阻断其表达有望成为哮喘治疗的新途径,本文就应用寡核苷酸阻断STAT6靶点治疗哮喘作一综述。

　　1 STAT6-哮喘治疗的新靶点

　　STAT6在胞质内是作为一种潜伏的单体形式存在，当IL-4 同膜受体( IL-4Rα) 发生作用,引起酪氨酸系统(JAKs) 的激活,进而激活胞浆内STAT6 ,引起该蛋白Y641 位点上的酪氨酸残基磷酸化,激活的SH2 区域发生同源或异源二聚化而形成二聚体，二聚体进入细胞核内与特定的DNA 位点结合,引起IL-4 相关基因(如IgE、IL-4R、Eotaxin、FcR、Ⅱ类MHC 等) 的表达。STAT6经历着一个不断磷酸化、形成二聚体、转移胞核内、与DNA结合、再去磷酸化失活的循环过程[2-3]。JAK/STAT6通路上游刺激因子是IL-4、IL-13等细胞因子，而这些因子也正是支气管哮喘发生机制中的重要因子。而STAT6 第400 至第500 位氨基酸片段具有DNA 结合特异性, STAT6 与核内DNA 结合的最佳碱基序列为TTN6AA ,若该片段氨基酸发生变异, STAT6 虽然能够磷酸化、二聚化,但进入核内不能与DNA 结合,从而失去转录活性，故可能成为哮喘治疗新的分子靶点。哮喘患者气道上皮细胞存在STAT6的表达，而且气道上皮细胞是哮喘主要的STAT6高表达细胞[4]。通过基因缺陷研究发现：哮喘小鼠气道内粘液腺体增生、杯状细胞肥大、上皮剥脱、气道炎性细胞浸润以及气道高反应性与STAT6基因表达密切相关。研究表明抗原介导的STAT6 +/+ 小鼠肺内炎性细胞浸润,肺泡灌洗液IL-4 、IL-5 的水平升高,血清中IgE 浓度升高,气道杯状细胞肥大及气道粘蛋白的增多都取决于STAT6 的信号转导激活所致的Th2优势应答[5]。Matsukura 等[6]报道,IL-13通过STAT6的信号转导促进Eotaxin 基因的转录,调节嗜酸粒细胞趋化和Th2细胞的激活。STAT6-/-小鼠Eotaxin 合成下降, 致敏后气道嗜酸粒细胞浸润减轻。Zamorano等[7]也证实STAT6对B细胞的增殖和分化影响存在特定的信号激活通路，即IL-4/STAT6通路。由此可见, STAT6 在Th2优势分化，促进B细胞增殖分化，参与IgE同型转换及支气管哮喘起到病理生理学变化等方面起着非常重要的作用。这可能为人们设计一种新药,通过调控STAT6 所介导的信号转导系统来调控免疫系统,为防治哮喘提供一种新思路。

　　2 寡核苷酸治疗哮喘概述

　　近年来，随着分子生物学及分子免疫学等学科的发展，对哮喘目的基因的研究成为了哮喘防治研究中的重点，而寡核苷酸疗法更是成为了其中的热点。已有针对细胞因子及受体，转录因子及转录蛋白激酶，信号传导和转录激活因子等的寡核苷酸治疗方式。本文着重从反义寡核苷酸及圈套寡核苷酸两种治疗方式来阐述针对STAT6的寡核苷酸治疗。

　　2.1 反义寡核苷酸

　　反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASONs)是一类分子量小，一般由15～25个核苷酸组成的、可扩散的核苷酸片段及化学修饰物，是一种单链核苷酸，包括反义DNA和反义RNA。反义寡核苷酸可特异性地与靶基因或mRNA结合，通过抑制基因转录，促进RNA酶H(Rnase—H)清除杂交的mRNA，阻碍mRNA从胞核进入胞浆，影响mRNA成熟及阻断蛋白质翻译等机制实现基因调控与疾病治疗。反义寡核苷酸主要来源有三种途径：(1)人工反义RNA表达载体的构建。(2)利用诱生剂诱生反义核酸。(3)人工合成反义寡核苷酸。以人工合成途径最为常用。STAT6反义寡核苷酸是指通过人工合成一段与STAT6互补寡核苷酸单链，同STAT6结合，抑制其基因转录，进而不能发挥其生物学效应。Sandra Hill[8]等应用一段STAT6 AS-ODNs 转染至人肺上皮A594细胞，产生剂量依赖的STAT6 mRNA及蛋白下降，且抑制IgE转型因子的转录;Qi Peng[9]等发现在人工培养的人类气道平滑肌上皮细胞中STAT6 AS-ODNs选择性的下调STAT6蛋白，有效阻止嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)mRNA的表达以及其蛋白的表达;Danahay H[10]等也证明STAT6 AS-ODN在活体小鼠模型能够下调STAT6 mRNA及蛋白水平;赵鹰[11]等也发现STAT6 AS-ODN可特异性抑制哮喘小鼠脾淋巴细胞中STAT6蛋白的表达，并可特异性抑制脾淋巴细胞中IL-4的分泌。因此，反义寡核苷酸针对STAT6信号传导系统对哮喘的治疗是有效地。反义寡核苷酸比传统化学药物的特异性高，有效作用时间长，便于体外调控，不通过血脑屏障、胎盘，可避免常规化学药物的一些副作用。能以序列特异性方式和DNA分子中的互补碱基序列杂交，通过直接抑制或干扰DNA编码特异蛋白的过程，阻断基因表达，具有高效、特异、设计方便、不良反应小等优点。但反义寡核苷酸的实际应用也存在挑战，ODNs的稳定性、AS-ODN的毒性作用、体内有效输送到靶部位和ODN穿透细胞的能力等，且制备反义核酸价格昂贵。这些都成为实际运用的阻碍。无论如何，针对STAT6信号传导系统的反义寡核苷酸技术能有效的抑制哮喘气道炎性因子的释放，减少气道炎性细胞浸润，从而达到治疗哮喘的目的，为我们治疗支气管哮喘提供了新的途径。总体来说，如何低成本的大量制备反义核酸、提高ODN稳定性、寻找新的寡核苷酸载体以及更有效的给药方式、减少脱靶效应与毒性仍然是进一步研究的重点。

　　2.2 圈套寡核苷酸

　　转录因子圈套策略(Transcription factor decoy，TF decoy)是目前新型的基因治疗手段之一。其作用原理是：应用人工合成与转录因子作用的顺式元件(cis-element)相一致的高亲和力的双链寡核苷酸 (ODN)作为圈套 ODN ，竞争抑制转录因子的功能,使转录因子丧失或减少与内源性基因作用的能力或从作用部位脱离 ,导致基因表达抑制，最终达到基因治疗和基因调控的目的[12]。此策略简单有效,成为近来基因治疗和调控内源性基因表达的研究热点。针对STAT6的作用特点 ，2000年Li Hua Wang[13]等人设计合成了一段外源性STAT6顺式作用元件，将其转入细胞，竞争性地抑制STAT6与顺式元件的结合，竞争性占有STAT6与DNA结合终点，致其不能结合到靶基因的启动子区域，从而失去其转录活性，使得IL-4不能诱导小鼠T细胞的分化增值，抑制Th2细胞的优势应答。而且这种STAT6圈套寡核苷酸具有特异性，只影响STAT6与顺式作用元件的粘附，并不影响其酪氨酸残基磷酸化、IL-4受体链的表达，及IL-2对T细胞的诱导作用。2004年H Yokozeki[14]等针对STAT6信号传导通路，首次将圈套技术应用在遗传过敏性皮炎活体小鼠上，研究发现STAT6圈套ODN转染的小鼠能有效改善IgE诱导遗传过敏性皮炎晚期反应，并且在组织学上中性粒细胞及嗜酸性粒细胞明显减少。2009年[15]该研究机构又将此技术应用到人体上—STAT6圈套ODN软膏在遗传过敏性皮炎成人中的试验性研究，且试验证明有效，为后期进入临床奠定了基础。虽然目前还没有正式文献关于STAT6圈套OND在支气管哮喘活体上的研究，但该技术在皮肤疾病上的应用，已经为我们提供了很好的借鉴。相比较反义ODN而言，TF圈套OND疗法具有以下优点：1、双链稳定性高;2、一个圈套ODN能抑制在启动子区内由同一个顺式元件调控的多个基因;3、圈套ODN不仅有抑制TF的作用，还能抑制后续的翻译过程;4、圈套OND的合成序列特异，相对简单并能被靶向结合。比之反义OND应用前景更为优越。但也存在许多问题，如何提高转染率增加细胞的摄取，如何增强其稳定性提高其半衰期减少非特异性效应等问题[16-17]。这些问题都阻碍着针对STAT6的圈套OND在临床上的应用。虽然如此，但转录因子圈套技术在其他领域如肿瘤、血液系统疾病、肾小球疾病、器官移植等方面取得了巨大的进步。因此，相信随着寡核苷酸自我修饰的完善和转染方法的提高，TF圈套OND将在未来的哮喘研究发挥更大的作用。

　　3 总结与展望

　　STAT6通过信号传导作用，促进相关基因的转录，调节Th2优势应答，促进B细胞分化和IgE的类型转换，从而介导支气管哮喘的气道炎症和气道高反应性，在支气管哮喘的发病中起了非常重要的作用。寡核苷酸技术因其具有特异性强，副作用小，直达靶位的优点，已经在众多领域中得到应用，虽然在稳定性，转染方式等方面存在亟待解决的问题，但我们相信，随着科学技术的发展，寡核苷酸技术将成为临床治疗中新的方法。以STAT6信号传导通路为靶点的寡核苷酸技术将成为哮喘等变应性疾病治疗的一个新领域和重要的发展方向。

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