金森病细胞模型中膜联蛋白A7氧化修饰水平的变化

　　作者：张颖,赵珩,王春艳,常,明,胡林森　　作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春

　　【摘要】目的 探讨膜联蛋白A7氧化修饰水平变化在帕金森病(PD)发病机制中的可能作用。方法 应用10 μmol/L PSI处理PC12细胞24 h建立PD细胞模型。通过2，4二硝基苯肼(DNP)的衍生将含有羰基的氧化蛋白质标记上。首次采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与免疫印迹技术相结合的方法比较PD细胞模型和正常对照组中膜联蛋白A7氧化修饰水平的变化。结果 与对照组比较，PD细胞模型中膜联蛋白A7氧化修饰水平显著降低(P<0.05)。结论 膜联蛋白A7氧化修饰水平变化可能为PD发病机制的研究提供新线索。

　　【关键词】 帕金森病;膜联蛋白A7;发病机制;氧化修饰;蛋白质组学鉴定

　　研究表明，帕金森病(PD)黑质多巴胺能神经元内蛋白质羰基水平显著升高〔1〕。因此，目前多数学者将兴趣集中于氧化应激损害，认为氧化应激在PD黑质多巴胺能神经元死亡过程中起重要作用。迄今为止，尚未见膜联蛋白A7(annexin A7)发生氧化修饰的报道。本实验通过2，4二硝基苯肼(DNP)的衍生步骤将含有羰基的氧化蛋白质标记上，而后采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western印迹技术相结合的方法首次发现了annexin A7氧化修饰。期望为PD发病机制的研究及治疗药物的研发提供线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器 PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。高糖DMEM培养基购自Gibco公司。新生牛血清由杭州四季青生物制品厂生产。吖啶橙、二抗、显色液等购自Sigma公司。溴化乙啶为Amresco产品。荧光倒置相差显微镜为日本Olympus产品;低温高速离心机为Heraeus Sepatech产品。DNP购自东京化工业株式会社。一抗购自Molecular Probe公司。硝纤膜、Cleanup及2D Quant试剂盒、固相13 cm IPG胶条、聚焦仪、电泳系统、凝胶图像扫描仪、2D Evolution分析软件和质谱仪为Amersham Biosciences公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PD细胞模型的建立 PC12细胞复苏后，以2×105/ml的密度接种于底面积25 cm2的塑料培养瓶(10 ml/瓶)，于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。每2～3 d更换1次培养液。选取对数生长期细胞进行传代。细胞以1×105/ml密度接种于底面积25 cm2的塑料培养瓶。24 h后更换培养液，实验组加入终浓度10 μmol/L的PSI(以DMSO溶解)，对照组加入DMSO，实验组与对照组DMSO终浓度均为0.1%，继续孵育24 h后收集两组细胞用于实验。MTT法检测细胞存活率;吖啶橙和溴化乙啶染色观察细胞凋亡的存在;HE染色观察细胞内包含体的形成。

　　1.2.2 蛋白样品的制备 倾去培养液，以冷PBS洗涤3次，计算细胞重量。按重量比1∶10加入裂解液，室温作用1 h。离心30 min，收集上清液。应用Cleanup试剂盒去除杂质，2D Quant定量试剂盒进行蛋白质定量(样品浓度控制在5～10 mg/ml)。

　　1.2.3 一向等电聚焦电泳及IPG胶条的DNP衍生 240 μg样品与一向电泳缓冲液混合后均匀加入胶条槽，IPG胶条胶面朝下放入胶条槽，在电泳仪上进行水化及等电聚焦电泳。而后将IPG胶条在含20 mmol/L DNP的2 mol/L的HCl溶液中室温孵育20 min，而后在含30%甘油的2 mol/L TrisBase溶液中洗15 min。

　　1.2.4 二向凝胶电泳 将平衡后的IPG胶条转移至12.5% SDSPAGE凝胶(16 cm×15 cm×1.0 mm)上端，在垂直电泳仪上进行二向电泳。待溴酚蓝距底边约4 cm时停止电泳。

　　1.2.5 分析胶进行免疫印迹染色 将用作分析胶的二向胶电转移至硝酸纤维素膜。以3%BSA/TBST封闭硝酸纤维素膜。以1∶200的兔抗鼠DNP抗体作为一抗，4℃过夜孵育。以1∶10 000的羊抗兔碱性磷酸酶偶联抗体作为二抗，室温孵育1 h。以BCIP/NBT溶液作为显色液，至蓝紫色蛋白点清晰呈现后，以双蒸水终止反应。

　　1.2.6 制备胶进行热考马斯亮蓝染色 制备胶于20% TCA中固定2 h以上。蒸馏水漂洗凝胶20 min，加入热考染液，50℃摇床振荡30 min。加入脱色液，50℃摇床振荡脱色，每次1 h，以背景蓝色脱净为止。

　　1.2.7 图像分析、统计学处理及质谱鉴定 扫描Western印迹及考染的制备胶图像，应用Image Master 2D Evolution软件进行分析，在制备胶上找到与Western印迹结果相匹配的蛋白点。以单个蛋白抗DNP免疫染色强度/制备胶蛋白考染强度来标准化蛋白的氧化水平，对来自4次重复实验的结果以x±s表示，采用t检验。对与对照组比较PSI处理组氧化水平有显著差异的蛋白点进一步做质谱鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 细胞模型结果 10 μmol/L PSI作用PC12细胞24 h的情况下，细胞存活率降至(85.46±1.75)%，与对照组(高为100%)比较有显著性差异(P<0.05)，且细胞多数处于凋亡出现及包涵体形成阶段，能很好地模拟PD的两大基本病理特征，即神经元丧失(凋亡)和神经元内嗜酸性包含体的形成。因此，10 μmol/L PSI作用24 h的PC12细胞可作为研究PD发病机制及PD药物治疗的可靠模型。

　　2.2 蛋白质的鉴定结果 扫描考染的制备胶及Western印迹图像，可见制备胶上的蛋白点与Western印迹图像匹配较好(见图1)。应用2D Evolution软件进行分析，与对照组比较有统计学意义的表达显著降低的蛋白点有8个(P<0.05)，其中仅蛋白点99被质谱鉴定出来，为annexin A7。蛋白点99在对照组的氧化水平为9.295 1±1.412 2，实验组的氧化水平为6.530 8±0.839 1(t=2.914 7，P<0.05)。NCBI蛋白质数据库提供的蛋白点99的详细信息为：蛋白质编码gi 18426844，蛋白质名称annexin A7，等电点5.9，分子量50.35 kD，期望值(鉴定结果的差错几率)0.000，序列覆盖率(已经鉴定的肽段序列占蛋白质总序列的百分比)19.9%，提示鉴定结果可信度较高。A和B：分别为对照组考马斯亮蓝染色显示的总蛋白及Western印迹显示的氧化蛋白点;C和D:分别为实验组考马斯亮蓝染色显示的总蛋白及Western印迹显示的氧化蛋白点(短线所示为蛋白点99)。

　　图1 蛋白点99在实验组和对照组考染的制备胶及Western印迹上表达比对

　　3 讨 论

　　PD的基本病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失，残存的神经元胞浆内出现嗜酸性包含体即Lewy小体。尸检研究表明PD黑质多巴胺能神经元内蛋白质羰基水平显著升高。羰基是蛋白质氧化的标志之一，反应性羰基作为氧化损伤的神经毒性介质涉及许多神经系统变性疾病的进展〔2〕。羰基通过修饰细胞亲核基团及破坏细胞动态平衡在神经变性病的发病机制中发挥重要作用〔3〕。

　　泛素蛋白酶体系统(UPS)是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径，可清除真核细胞内突变、损伤及异常折叠的蛋白质，起到调控蛋白质和维持细胞内环境稳定的作用〔4〕。有研究表明，蛋白酶体抑制剂处理的动物及细胞模型可导致自由基的生成及氧化应激，较全面地模拟PD的病理特征，如细胞凋亡死亡、αsynuclein异常、酪氨酸羟化酶损伤及包含体形成〔5，6〕，提示有必要在蛋白酶体抑制的PD模型中研究氧化应激机制。

　　本实验在蛋白酶体抑制的PD细胞模型中，首先通过DNP的衍生步骤将含有羰基的氧化蛋白质标记上，而后采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western印迹技术相结合的方法鉴定氧化修饰的蛋白质。结果首次在蛋白酶体抑制的PD模型中发现了annexin A7的氧化修饰，与对照组比较其氧化水平显著降低。

　　蛋白点99被鉴定为annexin A7。Annexin是一组高度同源的钙依赖磷脂结合蛋白，迄今为止在哺乳动物中已发现13种annexin。基于annexin A7在体外能聚集嗜铬颗粒，因而是第一个被分离的annexin钙结合蛋白〔7〕。除肾上腺髓质外，已在许多哺乳动物组织中检测到annexin A7，包括脑、肝脏、腮腺、脾、肺及骨骼肌〔8，9〕。在细胞水平，annexin A7涉及膜运输、胞外分泌、钙离子动态平衡及肿瘤抑制等多种生物学功能。

　　一些证据显示钙结合蛋白在损伤的和/或衰老的脑组织中发挥保护作用〔10〕。有研究表明在神经变性病AD中，表达高水平钙结合蛋白的神经元不发生变性〔11〕，表达钙结合蛋白的培养的神经细胞对兴奋性氨基酸或淀粉样肽诱导的细胞死亡有相当的抵抗性〔12〕。因此推测脑皮层神经元内annexin钙结合蛋白的丰富表达，可能是啮齿动物脑对AD型病理过程相对抵抗的一个因素。

　　Krapfenbauer等〔13〕用神经毒素海人藻酸处理大鼠脑组织，用蛋白质组学的方法检测到了在凋亡发生时annexin A7的丰度降低。Yu等〔14〕进一步发现，在凋亡因子刺激的条件下，annexin A7的下调可阻止半乳凝素3发挥抗凋亡作用。这提示本实验中annexin A7氧化修饰水平的降低可能与PD细胞模型中发生的凋亡有关;另一方面，残留annexin A7的氧化修饰则进一步影响其行使正常的生物学功能。钙离子依赖的信号转导路径功能异常可能涉及PD的发病机制，对信号转导路径关键步骤的干预可能阻止凋亡的进程。钙依赖的磷脂结合蛋白annexin A7在PD等神经系统变性病中的可能作用值得进一步深入研究，同时可能为PD分子靶向药物治疗的研发提供有价值的线索。

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