一氧化氮合酶在大鼠慢性阻塞性肺疾病模型中的表达

　　作者：李水霞 王秋枫 孙丽蓉 张建玲 李冬梅 马瑛 作者单位：(包头医学院第二附属医院呼吸内科，内蒙古包头 014030)

　　【摘要】 目的：通过观察一氧化氮合酶(NOS)在大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型肺内的表达与分布，探讨其在吸烟导致COPD中的作用机制。方法：30只健康雄性二级SD大鼠随机分为健康对照组(15只)和COPD模型组(15只)，采用烟熏加气管内滴入猪胰蛋白酶(PPE)联合的方法建立大鼠COPD模型，COPD模型制备后，行肺组织病理学检查;应用免疫组化方法观察肺内内皮型NOS(eNOS)、诱导型NOS(iNOS)的表达情况，且应用显微-微机图像处理系统进行定量分析。结果：联合应用烟熏和PPE在较短的时间内建立了较理想的COPD模型;一氧化氮合酶在正常肺组织与COPD的肺组织均有表达，主要定位在细胞浆内;免疫组化结果表明模型组iNOS在支气管黏膜上皮呈强阳性表达，肺血管eNOS表达明显减弱，与健康对照组比较有显著性(P<0.01)。结论：吸烟可引起iNOS的过量表达，引起肺部损伤，导致COPD的发生;同时大量吸烟可导致肺血管eNOS的表达减弱。

　　【关键词】 吸烟;慢性阻塞性肺疾病;动物模型;一氧化氮合酶

　　The Expression of Nitric Oxide Synthases in the Rat with　Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model

　　LI Shuixia,WANG Qiufeng,SUN Lirong,et al

　　(Respiration Medicine Department,the Second Affiliated Hospital, Baotou Medical College, Baotou 014010,China)

　　Abstract Objective: To observe the expression of nitric oxide synthases in rat models with chronic obstructive pulmonary disease to study the mechanism of COPD caused by smoking . Motheds: 30 male Wistar rats were randomly divided into two groups,the normal control group (A,n=15)and the model group (B,n=15).COPD model (model group) was established by endotracheal instillation of pancreas protein enzyme with exposure to cigarette smoke in very short time. After COPD model had been established, pulmonary and bronchial morphological changes were observed by light and electron microscopy. The quantitative pathological examination by image analysis was also performed .The expression of inducible NOS (iNOS) and endothelial NOS (eNOS) in inpulmonary tissue was observed by immunohistochemistry techniques. Results: We estalished ideal COPD models in stort time. There existed the expression of NOS in both the normal lung tissue and the lung tissue of COPD,mainly orienrared in the cytoplasm of cell.The immunohistochemical result indicated that iNOS increased significantly ,in comparison with the control group, in bronchiolar mycoderma epithelial and eNOS remakably decreased in pulmonary blood vessel. The expression of iNOS and eNOS were also markedly elevared (P<0.01). Conclusion: Smoking can induce overexpression of iNOS in pulmonary tissue, which might result in lung injury, COPD and weak expression of Enos in the pulmonary vessel.

　　Key words Smoking;COPD;Animal model;NOS

　　以往认为一氧化氮(NO)是存在于烟雾、臭氧和酸雨中的、污染空气的有毒成分。然而自从1987年发现哺乳动物血管内皮细胞能合成NO以来，NO生理和病理作用日益受到人们的重视。已证实NO有广泛的功能，包括血管调节、神经传导、宿主防御及细胞毒性作用，越来越多的证据表明NO在调节肺功能和肺疾病中起着重要作用。NOS是NO合成的最关键的限速酶，NOS有三种异构体，神经型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)，在肺组织中起作用的是iNOS和eNOS。本论文通过采用烟熏加气管内滴入猪胰蛋白酶(PPE)联合的方法，在较短的实验时间内建立稳定的大鼠COPD的动物模型，并应用免疫组织化学技术观察iNOS和eNOS在肺内的表达情况，以了解NOS在吸烟导致COPD发生中的作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 雄性二级SD大鼠30只(北京动物试验中心提供)，鼠龄8周龄，体重150～170g。将动物随机分为COPD模型组和健康对照组，每组15只。COPD模型组采用熏烟(安徽芜湖卷烟厂出品的都宝牌香烟)加气管内滴入猪胰蛋白酶(PPE)法(AMRESCO公司提供)，即实验第1、15天经气管内滴入PPE 0.5mg/kg,次日开始熏5%香烟，0.5h/每日上午。健康对照组采用气管内注入生理盐水，二级动物房内饲养。从开始实验起，第10周处死模型组和对照组。

　　1.2 病理标本的处理3%戊巴比妥纳麻醉大鼠，股动脉放血处死大鼠，迅速把右肺中下叶放入中性福尔马林中侵泡24h以上，石蜡包埋切片，分别作苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化染色，光学显微镜观察。

　　1.3 免疫组织化学技术 iNOS和eNOS的检测采用免疫组化染色法，一抗为兔抗鼠iNOS、eNOS(北京博奥森生物技术有限公司提供)，二抗为生物素标记物第二抗体，DAB染色，苏木素套染，阳性结果呈棕黄色。以0.1M PBS液代替一抗进行染色，作为阴性对照。每只大鼠选一张肺组织切片，每张切片随机选取2～3个支气管和肺血管，取其平均值。用显微-微机图像分析仪检测平均吸光度值，作为iNOS和eNOS的相对含量。

　　1.4 统计学分析数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.0软件进行组间t检验。

　　2 结果

　　2.1 光镜观察健康对照组大鼠支气管肺组织上皮结构完整，支气管纤毛排列整齐，肺泡结构完整，在纤毛结构间夹杂有少数杯状细胞，管壁内有少数散在的淋巴细胞。

　　COPD模型组肺组织支气管纤毛柱状上皮细胞部分剥脱，纤毛粘连倒伏变性和坏死，有的纤毛明显脱落，杯状细胞增生，黏膜下层及肌层大量炎性细胞浸润，可见支气管平滑肌明显增厚，管腔内充满大量中性粒细胞、肺泡巨噬细胞及黏液分泌物，肺泡扩张融合，肺泡隔明显增厚，其中可见炎细胞浸润和毛细血管扩张充血，见图1、图2。

　　2.2 免疫组织化学染色结果健康对照组肺组织中iNOS表达呈弱阳性，主要存在于支气管上皮。模型组表达呈强阳性(P<0.01),主要存在于支气管上皮和肺泡上皮。健康对照组肺血管内皮细胞eNOS表达呈强阳性，模型组表达明显减弱(P<0.01)，见图3、图4、图5、图6、图7、图8。

　　图1 (略)

　　图2　(略)

　　图3 (略)

　　图4 (略)

　　图5 (略)

　　图6 (略)

　　图7 (略)

　　图8 (略)

　　表1 大鼠iNOS、eNOS表达的OD值(略)

　　注：*与对照组比较，P<0.01

　　3 讨论

　　NO是一多功能分子，在呼吸系统的生理和病理过程中起重要作用。NO由L-精氨酸经NOS催化生成。NOS有3种形式：2种原生型NOS(cNOS)，包括内皮型NOS(eNOS)和神经元型NOS(nNOS)，1种诱导型NOS(iNOS)[1-2]。正常情况下，cNOS有一定的生物活性，对于影响支气管和血管平滑肌的反应性、调节气道的非肾上腺性、非胆碱能性神经反射，抑制血小板聚集以及调节炎细胞与血管内皮细胞之间的关系起重要作用[3]。iNOS在正常的气道上皮及巨噬细胞可有表达，产生一定量的NO，可抵抗外界有害物质的侵袭，维持呼吸道纤毛的运动。

　　多数研究表明，呼吸道NO可产生于不同的细胞、包括上皮细胞、气道的神经细胞、炎性细胞(巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞)及血管内皮细胞[4-7]。一些研究表明eNOS存在于血小板、神经细胞、上皮细胞和内皮细胞中,在激动剂(如乙酰胆碱、缓激肽)的刺激下，几秒钟内释放少量NO。iNOS广泛存在于巨噬细胞、中性粒细胞、肝细胞、初级胶质细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等，在细胞因子、内毒素等刺激物的诱导下才能表达，几小时后生成大量NO。研究表明，eNOS产生低浓度NO有保护支气管过度收缩、调节肺血流和免疫防御的作用，而iNOS产生大量NO可导致气道炎症反应和组织损伤[6-7]。

　　在生理状态下iNOS的表达较弱，可被多种细胞因子如INF-γ、IL-β、TNF-α和内毒素诱导激活，产生高浓度的NO,在介导炎症反应方面起重要作用[8]。体内实验证明，应用LPS刺激后，肺组织内iNOS活性明显增强，iNOS mRNA表达增强，NO水平明显升高。体外实验也证明，应用LPS激活鼠肺泡巨噬细胞后，其iNOS阳性表达明显增强、NO产生增多、TNF等促炎因子释放量增加[9]。本实验中，COPD模型组肺泡上皮、支气管上皮及巨噬细胞iNOS均呈强阳性表达，这表明烟雾可激活肺内的炎性细胞，产生细胞因子，后者又可刺激巨噬细胞产生大量的iNOS，而生成过量的NO，造成上皮损伤。同时，烟雾中含有大量的超氧阴离子，与NO反应生成过氧亚硝酸离子和过氧亚硝酸盐，前者为强氧化剂，后者有细胞毒作用。两者可以诱导产生脂质过氧化物，干扰多种酶的作用途径，也可以与铁及铁蛋白反应生成毒性亚硝基化合物，从而造成肺部损伤。

　　内皮细胞能够产生NO，体外研究表明，应用NOS抑制剂或去除内皮细胞可减少NO的产生。慢性缺氧可引起eNOS活性下降，NO产生减少。Naoki等[10]在缺氧条件下(3% O2)对内皮细胞进行了培养，结果发现，培养48h后，内皮细胞内的eNOS蛋白含量和eNOS mRNA水平分别下降4倍和9倍。本实验中模型组肺血管内皮细胞eNOS的表达明显低于正常对照组，这是由于烟草中的有害物质可造成血管内皮结构的严重破坏，使其分泌eNOS减少，导致血管内皮细胞合成NO减少。另一方面，可能是因为大量吸烟导致血液中的血红蛋白携带氧的能力下降，造成肺组织的慢性缺氧，最终导致eNOS的合成减少。

　　【参考文献】

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　　[9] 张旭晨，阮英茆，韩晓男，等.肺舒灵对金黄地鼠肺泡巨噬细胞表达一氧化氮合酶和产生一氧化氮的影响[J].中国中药杂志,1999,40(6):366-368.

　　[10] Naoki K,Yamaguchi K,Suzuke K，et al.Nitric oxide differentially attenuates microvessel response to hypoxia and hypercapnia in injured lungs[J].Am J Physiol,1999，277(lpt2):191-199.