雷公藤甲素对哮喘小鼠气道重塑及转化生长因子-β1表达的影响

　　作者：吕志强1， 陈 茗1， 江山平1*， 谭艳芳1， 张 蔚1， 梁瑞韵1， 李海刚2 作者单位：(中山大学附属第二医院 1. 呼吸内科; 2. 病理科， 广东 广州 510120)

　　【摘要】 【目的】 探讨雷公藤甲素对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠气道重塑的影响。【方法】 40只雌性SPF级BABL/c小鼠，随机数字表法分为4组，每组10只。A组为生理盐水对照组;B组为卵蛋白(OVA)哮喘组;C组为雷公藤甲素治疗组;D组为地塞米松治疗组。在末次激发24 h后所有小鼠取左肺组织行苏木精-伊红(HE)染色，过碘酸-雪夫(PAS)染色，Masson三色染色以及抗转化生长因子β1(TGF-β1)抗体免疫组化染色。测定支气管管壁厚度(WAt/Pbm)，支气管平滑肌厚度(WAm/Pbm)。取右肺组织行RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达。【结果】 B组小鼠支气管管壁厚度、杯状细胞百分数、气道平滑肌厚度、胶原纤维面积、TGF-β1的转录和表达水平均显著高于A组(P < 0.01)。C组小鼠上述各指标依次均显著低于B组(P < 0.05)，D组小鼠上述指标显著低于B组(P < 0.05)。但C组和D组上述各指标间差异无统计学意义(P > 0.05)。肺组织的TGF-β1的蛋白表达水平与支气管的管壁厚度，平滑肌厚度，杯状细胞比，胶原纤维含量成正相关(相关系数分别为0.755、0.815、0.898、0.837;P < 0.01)。 【结论】 雷公藤甲素可抑制BABL/c哮喘小鼠气道重塑的发生，其机制有可能是通过抑制TGF-β1的表达而实现的。

　　【关键词】 哮喘; 气道重塑; 小鼠; 雷公藤甲素

　　Effects of Triptolide on Airway Remodeling and TGF-β1 Expression

　　in Asthmatic Mice

　　LV Zhi-qiang1， CHEN Ming1， JIANG Shan-ping1*， TAN Yan-fang1， ZHANG Wei1，

　　LIANG Rui-yun1， LI Hai-gang2

　　(1. Department of Respiratory Medicine; 2. Department of Pathology， The Second Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University，

　　Guangzhou 510120， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of triptolide on airway remodeling in asthmatic mice. 【Methods】 Forty female BABL/c mice were randomly divided into four groups with 10 mice in each group. ①Group A(control group)：mice were treated with saline; ②Group B(asthmatic group)：mice were sensitized and challenged with OVA; ③Group C(triptolide group)：mice were sensitized and challenged as asthmatic group， and treated with 40 μg triptolide before challenged; ④Group D(dexamethasone group)：mice were sensitized and challenged as above，and were given 2 mg dexamethasone by intraperitoneal injection before challenged. All mice were killed 24 h after the final OVA challenge. The left lung was isolated for pathological examination. Lung sections were stained with hematoxylin and eosin (HE)， PAS， Masson?蒺s trichrome and immunohistochemical staining for TGF-β1 were performed.The thickness of bronchial airway (WAt/Pbm)， the percentage of goblet cells， bronchial smooth muscle thickness(WAm/Pbm)， and the collagen deposition area were measured， and RT-PCR was performed to detect the mRNA expression of TGF-β1 from the right lung tissues. 【Results】 Bronchial airway thickness， the percentage of goblet cells， bronchial smooth muscle thickness， the collagen deposition area， TGF-β1 mRNA and the expression of TGF-β1 in group B were significantly higher than those of group A(P < 0.01). The above index in group C and group D were significantly lower than those of group B(P < 0.05). comFor index mentioned above， there were no significant differences between group C and group D(P > 0.05). The changes of TGF-β1 expression were correlated significantly with bronchial airway thickness， the percentage of goblet cells， bronchial smooth muscle thickness， and the collagen deposition area(r = 0.755，0.815，0.898，0.837， P < 0.01). 【Conclusions】 Triptolide can inhibit the development of airway remodeling in asthmatic mice，and the possible mechanism may be due to reduce expression of TGF-β1.

　　Key words： asthma; airway remodeling; mice; triptolide

　　[J SUN Yat?鄄sen Univ(Med Sci)，2009，30(5)：537-542]

　　气道重塑(airway remodeling)是支气管哮喘的重要特征之一。其病理学特点包括气道上皮损伤，上皮下纤维化，蛋白多糖沉积，弹性蛋白增加，平滑肌增生肥大，黏液腺增生、化生和新血管的生长和增生[1]。文献报道转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在哮喘气道重塑的发生中起重要作用[2]。雷公藤属卫矛科植物，具有扰炎及免疫调节作用[3]。我们近期的研究提示雷公藤甲素是治疗糖皮质激素抵抗型支气管哮喘的有效选择[4]。本研究探讨雷公藤甲素对哮喘小鼠肺组织TGF-β1表达和气道重塑的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　动物：雌性SPF级BABL/c纯系小鼠40只，鼠龄6 ～ 8周，体质量l6 ～ 20 g，购自中山大学实验动物中心，(合格证号：广东省实验动物检测所合格证2006A059号)。所有小鼠饲养于中山大学实验动物中心，SPF级实验室。

　　主要试剂：OVA(V级、纯度 > 98%，美国Sigma公司);雷公藤甲素(上海博升生物科技有限公司);氢氧化铝(广州化学试剂厂);TGF-β1大鼠抗小鼠多克隆抗体(美国ABCam公司);链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化检测试剂盒(福建迈新生物技术开发公司);Trizol(美国Invitrogen公司);PCR试剂盒(美国promega公司);逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)。

　　设备：雾化器(boy037G6000型，德国Pari公司)、聚合酶链反应扩增仪(GeneAmp2700型，美国PE公司)、凝胶电泳槽来(美国Bio-Rad公司)、凝胶数字成像系统(美国Bio-Rad公司)、image-pro plus6.0图像分析软件(美国MediaCybernetics公司)、Nikon TE2000-U倒置显微镜(日本尼康公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 动物分组及哮喘模型的建立 小鼠按随机数字表法分为4组，每组10只。①生理盐水(NS)对照组(A组)：小鼠在致敏阶段给予NS 1 mL腹腔注射，激发阶段给予NS雾化吸入。②哮喘组(B组)：小鼠分别于第1、14 天腹腔注射1 mL致敏液(OVA 10 μg + 氢氧化铝1 mg);从第21 天开始为激发阶段，将小鼠置于约0.5 m × 0.5 m × 0.5 m大小的雾化吸入箱中，通过PARI MONDIAL 037型超声雾化器雾化吸入25 g/L OVA溶液5 mL，每次30 min，每周雾化3次，连续8周[5-6];③雷公藤甲素治疗组(C组)：以上述同样方法用OVA进行致敏和激发小鼠，在每次雾化激发哮喘前30 min腹腔注射雷公藤甲素40 μg/kg[7-8];④地塞米松治疗组(D组)：以上述同样方法用OVA进行致敏和激发小鼠，在每次雾化激发哮喘前30 min腹腔注射地塞米松2 mg/kg[9-10]。

　　1.2.2 标本收集 各组小鼠雾化吸人24 h后，以10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，取右肺组织置于液氮罐中保存，以备抽提RNA。左肺组织以20 cmH2O(1 cmH2O = 0.098 kPa)压力灌注40 g/L的多聚甲醛-磷酸盐缓冲液(PBS)，然后浸泡在多聚甲醛-PBS液中24 h。

　　1.2.3 组织学检查 肺组织经甲醛固定后，常规脱水包埋，并做苏木精-伊红(HE)染色，过碘酸-雪夫(PAS)染色，Masson三色染色和用抗TGF-β1抗体行免疫组化染色。每只小鼠随机选3张肺组织切片，每张切片以单盲法随机选取横断面较圆、直径100 μm的细支气管5支观察。采用美国MediaCybernetics公司image-pro plus6.0图像分析软件分别测量支气管基底膜周径(Pbm，μm)、总管壁的面积(WAt，μm2)、管壁平滑肌层面积(WAm，μm2)、支气管周围胶原纤维面积(μm2)。所有测量值均用相应的Pbm标准化，分别以WAt/Pbm，WAm/Pbm表示，代表相应管壁层的厚度，并以校正后的胶原纤维面积(μm2/μm)表示胶原纤维含量，以杯状细胞占所在支气管上皮细胞的比例表示气道的黏液分泌能力。

　　1.2.4 RT-PCR流程 取液氮保存的肺组织，剪取100 mg加1 mL RNA提取液Trizol进行匀浆，氯仿沉淀DNA和蛋白质后取上清液，加异丙醇沉淀RNA，750 mL、/L 乙醇洗涤后加相应的DEPC水进行溶解。取1 μg的总RNA按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以此为模板行PCR扩增。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列TGF-β1：上游引物，5′-ACCTGCAAGACCATCGACAT-3′;下游引物：5′-GGTTTTCTCATAGATGGCGT-3′;产物长度：279 bp。β-actin为内参照，引物序列如下：上游引物，5′-CAGAAGGACTCCTACGTG-3′;下游引物：5′-GCTCGTCAGGATCTTCATG-3′;产物长度：440 bp。TGF-β1按以下条件进行RT-PCR反应：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，反应35个循环后，再72 ℃延伸10 min。β-actin以下条件进行RT-PCR反应：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，反应35个循环后，再72 ℃延伸10 min。将产物在2%琼脂糖凝胶电泳(80 V，30 min)，在紫外灯下检测并照相。应用Scion Image软件对电泳条带进行光密度扫描，以面积×密度表示条带的丰度，以此作为mRNA表达的强度，采用beta-actin作为内参照，TGF-β1 mRNA的相对表达水平采用TGF-β1：beta-actin计算得出。

　　1.2.5 免疫组化流程及半定量测定 使用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase，SP法)进行检测。组织切片脱蜡后置于0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH值6.0)微波15 min抗原修复，冷却后用3 g/L H2O2处理30 min(37 ℃)，灭活内源性过氧化物酶;1：10正常马血清封闭30 min(37 ℃);弃上清液后直接加一抗抗鼠TGF-β1(1：400稀释)，4 ℃过夜;依次加羊抗鼠抗体与辣根过氧化酶室温下各孵育30 min(37 ℃);滴加二氨基联苯胺(DAB)，室温显色。结果判定为阳性细胞呈棕色，阳性信号为胞浆/胞核内棕黄色颗粒。采用Image-pro Plus6.0图像分析软件测定TGF-β1含量，以校正后的平均光密度表示。平均光密度为累积光密度(IOD SUM)除以选定区域的面积(area SUM)。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据以x ± s表示，数据运用SPSS 13.0统计软件处理，各组计量数据采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05为差异有显著性。两变量的相关分析采用Bivariate过程的等级Pearson相关法。

　　2 结 果

　　2.1 肺组织的病理学改变

　　光镜下观察HE染色结果显示，A组动物的气道无明显改变;B组气道壁及气道平滑肌明显增厚，黏膜下层增宽，黏膜上皮增生，管腔内可见上皮脱落;C组D组上述改变较B组明显减轻(图1 A ～ D)。

　　2.2 肺组织形态测定图像分析

　　图像分析结果显示，WAt/Pbm：A组显著低于B组、C组和D组差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组显著低于B组差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组比较差异无统计学意义(P>0.05)。WAm/Pbm： A组显著低于B组、C组和D组差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组显著低于B组差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组比较差异无统计学意义(P > 0.05，表1)。

　　2.3 雷公藤甲素对气道上皮增生的影响

　　PAS染色结果显示，A组杯状细胞增生较少，B组杯状细胞增生明显，C组(雷公藤甲素治疗组)D组(激素治疗组)杯状细胞增生较B组少，但较A组明显。图像分析表明A组与B组、C组和D组比较差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组显著低于B组差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组比较差异无统计学意义(P > 0.05，表1，图1 E-H)。

　　2.4 雷公藤甲素对气道胶原沉积的影响

　　Masson染色结果显示A组小鼠气道周围胶原纤维沉积较少，B组小鼠气道周围胶原纤维沉积明显增多，C组(雷公藤甲素治疗组)和D组(激素治疗组)较B组减少。图像分析表明，A组与B组、C组和D组比较差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组显著低于B组差异有统计学意义(P < 0.01);C组和D组比较差异无统计学意义(P > 0.05，表1，图1 I-L)。

　　2.5 肺组织的TGF-β1的转录水平

　　B、C、D组的TGF-β1 mRNA的含量明显高于A组，差异有统计学意义(P < 0.01);B组的mRNA的含量高于C、D组，差异有统计学意义(P < 0.01);C、D组的mRNA的含量比较差异无统计学意义(P > 0.05，表2，图2)。

　　2.6 肺组织的TGF-β1的表达水平

　　TGF-β1主要表达在气道粘膜上皮层，在肺泡巨噬细胞、间质细胞和炎性细胞(主要嗜酸粒细胞)也有表达。光密度测定： B、C、D组的TGF-β1的光密度均明显高于A组，差异有统计学意义(P < 0.01);B组的光密度高于C、D组，差异有统计学意义(P < 0.01);C、D组的光密度比较差异无统计学意义(P > 0.05，表2，图3)。

　　2.7 相关性分析

　　肺组织的TGF-β1的蛋白表达水平与支气管的管壁厚度，平滑肌厚度，杯状细胞比，胶原纤维含量成正相关(相关系数分别为0.755、0.815、0.898、0.837;P<0.01)。

　　3 讨 论

　　气道重塑是支气管哮喘发病的重要特征之一，气道重塑是导致气道不可逆性阻塞和气道高反应性的主要病理基础，与哮喘的持续、严重程度、预后及治疗反应等密切相关。气道重塑主要包括气道管壁增厚、气道上皮下纤维化，平滑肌细胞增生、肥大，肌成纤维细胞增生以及腺上皮化生[1]。

　　3.1 雷公藤甲素在哮喘治疗中的应用

　　雷公藤甲素是从雷公藤中分离出来的二萜类化合物，是雷公藤中抗炎、免疫调节的主要有效成分。1987年来茶云[11]首次报道雷公藤多甙治疗重型、偏重型小儿哮喘取得良好疗效、激发了对雷公藤多甙以及雷公藤甲素等雷公藤提取物在哮喘病方面的临床、基础研究。本研究结果显示，雷公藤甲素治疗组的支气管壁厚度、平滑肌厚度、杯状细胞比、胶原纤维含量均较哮喘组明显降低，与地塞米松治疗组比较无显著差异，提示雷公藤甲素具有明显抑制气道重塑的作用。

　　3.2 TGF-β1在哮喘气道重塑的重要作用

　　在对哮喘气道重塑的研究中，国内外学者都认识到TGF-β1的重要作用[12]。转化生长因子β超家族在哺乳动物中包括30多种相关成员，有三个TGF-β亚型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)[13]。TGF-β1是一种重要的促纤维化细胞因子，在哮喘患者的气道中，上皮细胞，嗜酸粒细胞，平滑肌细胞分泌大量的TGF-β1，分泌出的TGF-β1反过来又促进平滑肌细胞和杯状细胞增生肥大，增加胶原和纤连蛋白合成，并促进其在细胞外基质沉积，导致管腔狭窄和不可逆的肺功能改变[14]。Vignola等[15]报道TGF-β1的表达与气道基底膜厚度、成纤维细胞数和(或)哮喘发作的严重程度呈正相关。

　　3.3 雷公藤甲素对哮喘小鼠气道重塑的机制

　　目前关于雷公藤对气道结构细胞分泌TGF-β1的影响的研究报道不多。本研究在OVA雾化吸入建立的动物慢性哮喘模型基础上，观察肺内TGF-β1 mRNA和蛋白的变化及其对哮喘小鼠气道重塑的影响。本研究发现，雷公藤甲素治疗组肺组织TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平显著低于哮喘对照组，且肺组织TGF-β1的蛋白表达水平与支气管的管壁厚度，平滑肌厚度，杯状细胞比，胶原纤维含量成正相关，提示雷公藤甲素对平滑肌增殖，气道上皮增生和胶原合成的抑制作用部分是通过抑制TGF-β1的表达而实现的。雷公藤甲素抑制哮喘小鼠气道重塑及TGF-β1表达的效果与地塞米松比较无明显差异，且无激素类似的副作用，表明雷公藤甲素在哮喘尤其是难治性哮喘、激素依赖性哮喘以及重症哮喘的治疗方面有进一步开发应用的价值。

　　综上所述，雷公藤甲素既能降低胶原纤维的合成，减轻网状基底膜层的增厚，也抑制平滑肌层的增厚和粘膜上皮增生，气道壁的增厚;同时雷公藤甲素显著减少气道壁TGF-β1 mRNA和TGF-β1的表达，推测雷公藤甲素对平滑肌增殖和胶原合成的抑制作用部分是通过抑制TGF-β1 mRNA和TGF-β1的表达而实现的，这可能是雷公藤甲素抑制气道重塑的机制之一。

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