人胚肺间充质干细胞对损伤肺组织的修复作用

　　作者：刘伟 钱东华 钱 明1 彭丽萍 作者单位：(吉林大学第一医院呼吸科，吉林 长春 130021)

　　【摘要】 目的 研究人胚肺间充质干细胞(MSCs)对损伤肺组织的修复作用。方法 通过动物体内实验和细胞体外培养实验，观察人MSCs对肺上皮细胞的生长调控。结果 人胚肺MSCs能有效调控肺泡上皮的生长。结论 人胚肺MSCs及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗COPD、病毒性肺炎造成的肺损伤提供新的生物治疗方法。

　　【关键词】 人;胚胎肺;间充质干细胞;损伤肺组织

　　人胚肺间充质干细胞(MSCs)可在体外扩增培养，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变，处于G0/G1期的细胞多，具有典型的干细胞增殖特点，其免疫表型与骨髓来源的MSC相似〔1〕，能够被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种组织细胞,为肺损伤的治疗提出了一个新的思路。本研究通过动物体内实验和细胞体外培养实验，观察人胚肺MSCs对肺上皮细胞的生长调控，证实在肺脏损伤后，人胚肺MSCs及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗慢性阻塞性肺病(COPD)、病毒性肺炎等造成的肺损伤提供新的生物治疗方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 MSC调控肺上皮细胞生长实验 动物体内实验：选用无免疫排斥反应的NOD/SCID小鼠并制备呼吸道上皮、肺泡上皮损伤模型。NOD/SCID小鼠经过137铯照射300 cGy。 分别输入荧光燃料标记的人胚肺MSCs、人骨髓MSCs，定期通过肺组织切片和PCR检测外源基因，观察细胞移植和生长情况。经尾静脉输入胎肺来源的PKH26荧光染料染色的MSCs 1×106和NOD/SCID鼠自身的骨髓1×107，2个月后小鼠断颈处死，肺脏组织冰冻切片，荧光显微镜观察PKH26荧光阳性的细胞分布。肺脏组织提取基因组DNA，PCR测定人源性特异基因Amelogenin,上游引物：5′ACCTCATCCTGGCCACCCTGC3′,下游引物5′AGGCTTGAGGCCAACCATCAG3′。PCR条件是96℃变性5 min,94℃变性1 min,60℃退火1 min,70℃延伸1 min,共30个循环，最后70℃延伸10 min。分别输入两种干细胞和条件培养液给肺损伤模型鼠，观察肺上皮损伤修复速度和程度。

　　1.2 体外细胞培养实验

　　1.2.1 建立人胚肺MSC滋养层细胞培养体系(方法同上)。

　　1.2.2 人胚肺MSC支持成人呼吸道上皮细胞生长的实验

　　1.2.2.1 主要试剂 蛋白酶型内皮细胞生长支持物(ECGS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素(INS)、转铁蛋白(TF)、甲状腺素(T3)、氢化可的松(HC)、抗角蛋白抗体、人胎盘胶原(HPC)均为Sigma产品，LSAB免疫组化试剂盒为Dako产品，MEM、DMEM/F12培养基、胎牛血清FCS为Gibco产品，L谷胺酰胺为Merck产品，余为国产分析纯。

　　1.2.2.2 培养器皿 24孔板为Coring产品，套皿(MillicellCMΦ12 mm)为Millpore产品，套皿用HPC按20 μg/cm2涂膜置室温18 h弃去多余HPC，室温干燥，临用前用PBS洗涤24孔板涂膜同上。

　　1.2.2.3 培养基配制 在DEMEM/F12培养基中加入10 μg/ml INS、0.4 μg/ml HC、5 μg/ml TF、20 ng/ml T3、25 ng/ml ECGS、1 mmol/L谷胺酰胺、100 IU/ml青霉素、50 μg/ml链霉素为无血清培养基。

　　1.2.2.4 气管上皮细胞分离和培养 新鲜气管标本取自意外死亡的健康成人，由本院提供无菌条件下，用冰冷PBS冲洗纵向。切开气管，机械剥离黏膜层，剪成23 mm长小片。同上PBS冲洗置于含蛋白酶0.5 mg/ml PBS中4℃过夜消化。用漩涡震荡器剧烈震荡消化后的黏膜碎片10余秒，吸管轻轻吹打数分钟，加FCS至终浓度为2.5终止酶反应，1 000 r/min离心10 min，弃上清MEM洗涤细胞2次。用含5FCS的DMEM/F12培养基配置成细胞悬液，台盼蓝拒染色检测活细胞数，按2.5×109个活细胞/cm2加入套皿，5% CO237℃培养24 h后换为无血清培养基，隔日换底层培养液一次。设置常规24孔板无血清培养为对照。

　　1.2.2.5 人胚肺MSCs对成人气道平滑肌细胞生长的影响 将前述获得的人胚肺MSCs贴壁细胞用胰酶消化，收集所有贴壁细胞，1 000r/min离心，洗涤2次后，计数，取10 ml同时加入0.8%甲纤素，15%MCM，30%人AB血清及适量IMDM，以1×106细胞加入24孔板平滑肌的培养基，未加入人胚肺MSC的气道上皮细胞为对照组，放入37℃5%CO2饱和湿度培养箱内，共同培养10～12 d，40～50个细胞为1个集落，观察气道平滑肌的生长情况，测定人胚肺间充质干细胞对气道平滑肌生长情况的影响(以细胞集落数计算)。

　　1.3 滋养层系统支持中晚期胎儿人胚肺上皮细胞生长的实验

　　1.3.1 滋养层系统的建立方法同上。

　　1.3.2 胚胎肺上皮细胞体外培养 采用组织块贴壁培养法，对药物引产的3～5个月胎龄胎儿肺组织进行原代培养，于5% CO2，37℃培养箱内培养，待细胞生长汇合后，采用0.05%胰酶、乙二胺四乙酸钠消化进行传代培养;培养基为含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的RPM1640(Gibco/BRL)。细胞按1∶3比例稀释，2～3 d细胞生长至饱和进行常规传代培养。

　　1.3.3 人胚肺MSC对胚胎肺上皮细胞生长的影响 将前述获得的人胚肺间充质贴壁细胞用胰酶消化，收集所有贴壁细胞，1 000 r/min离心，洗涤2次后，计数，取10 ml同时加入0.8%甲纤素，15%MCM，30%人AB血清及适量IMDM，以1×106细胞加入24孔平板平滑肌的培养基，未加入人胚肺MSCs的气道上皮细胞为对照组，放入37℃ 5% CO2饱和适度培养箱内，共同培养10～12 d，40～50个细胞为1个细胞集落，观察气道平滑肌的生长情况，测定人胚肺MSC对气道平滑肌生长情况的影响(以细胞集落计算)。

　　1.4 MSC条件培养液对成人呼吸道上皮生长的影响 收集各代的人胚肺MSCs上清液，低温离心10 min，3 000 r/min，取上清即得MSC培养液(FCM),用同样方法24孔板培养成人气道上皮细胞，将每孔中的人胚肺MSC以FCM代替，其余培养条件相同，40～50个细胞为1个集落，集落生长情况见表1。

　　1.5 统计学分析 组间比较采用t检验，计量资料采用x±s表示。表1 人胚肺MSC对成人气道上皮细胞及胚胎肺上皮细胞的影

　　2 结 果

　　2.1 动物体内实验结果 荧光显微镜下可见：输入人胚肺MSC和人骨髓MSC的鼠肺内可见，PKH26阳性的细胞散在分布，PCR测定对照组(未经输入细胞的NOD/CUID鼠为阳性)、实验组Amelogenin基因阳性。见图1。表明在肺脏损伤后，人胚肺来源的MSC可以在肺脏内分布，并长期定植，而人骨髓MSC同样可以定植。见图1。

　　图1 Amelogenin PCR 结果及NOD/CUID鼠肺脏荧光照片

　　图2 气管上皮细胞体外培养的形态(×40)2.2 体外细胞培养实验结果 人胚胎间MSC对气道平滑肌生长情况的影响 套皿接种气管上皮细胞20 h后，贴壁率约为80%，细胞体积较前增大，并进入分裂组，68 h后细胞增殖旺盛，呈现重叠生长，上层为较大的圆形细胞，下层为较小的圆形细胞。见图2A。比较套皿内气液界面培养的气管上皮细胞，发现采用无血清培养基与含5%FCS的培养基，在72 h前两者细胞增殖无明显差异;72 h后，含5%FSC的培养基中细胞增长明显变缓。在常规24孔板对照中，无血清培养的气管上皮细胞呈单层生长，为多角形，相嵌状，见图2B。人胚肺MSC与气道上皮细胞共同培养10～12 d后，可见上皮细胞呈集落生长，而无人胚肺MSC则不形成集落，而只以散在的细胞存在，见图3。

　　图3 MSC对气道上皮细胞生长的影响(×40)

　　图4 MSC对人胚肺上皮细胞生长的影响(×40)2.3 滋养层系统支持中晚期胎儿人胚肺上皮细胞生长的实验结果 HLEC细胞成岛样片状生长，细胞呈多边形，细胞间连接紧密，排列规则，单层生长，形态符合正常人肺上皮细胞特点。细胞生长特性稳定，如35代细胞在48 h的代龄为16.1 h，65代细胞的代龄为15.4 h，非常接近。该细胞目前在体外已连续传代112代，细胞形态、生长特性基本稳定，β半乳糖苷酶染色阳性的细胞在早代数(35代)和100代左右的HLEC细胞都只是偶尔可见，占总细胞的百分数接近零，未见阳性细胞随传代次数的增加而升高，无衰老迹象，说明该细胞可能已获得永生性。人胚肺MSC与气道细胞共同培养10～12 d，可见上皮细胞呈集落生长，细胞数明显增多，而无人胚肺MSC则集落数明显减少，见图4。

　　3 讨 论

　　目前COPD、病毒性肺炎等呼吸系统疾病造成肺损害的发生机制还不十分清楚,故现阶段仍无有效的治疗方法。近年来,干细胞的研究引起了人们的极大关注,而成体干细胞的可塑性研究是干细胞研究领域的热点之一,其中发现最早并且研究最多的是BMSCs。BMSCs在不同诱导条件下具有向心肌细胞、肝细胞、神经元及肺泡上皮细胞等分化的多项潜能〔2～4〕。在胎儿肺组织中含有大量的MSC,在出生后的小鼠肺组织也存在MSC〔5〕。在成人支气管组织、支气管肺泡灌洗液标本中也分离出了肺内源性MSC〔6〕。上述研究表明,在近端和远端不同部位的肺组织,都存在有MSC。肺MSC具有与骨髓MSC相似的细胞表型和分化功能,在体外可大量扩增,可能成为用于治疗肺疾病的种子细胞。

　　本研究选择人胚肺MSC，充分发掘其高度增殖和分化能力，并利用其胎儿组织相关抗原表达较弱，排斥反应轻的优点，使之更适合临床应用。选择成人的骨髓MSC与胚肺MSC比较，为进行自体移植治疗奠定实验基础。目前人们在很多组织中，如造血、神经、表皮、腺体等发现相应的促进生长、分化、成熟的细胞因子〔7〕，但尚未发现直接促进肺组织呼吸道黏膜上皮、肺泡上皮细胞生长成熟的细胞因子。本研究通过观察胚肺MSC培养液对损伤肺组织的修复作用，证实人胚肺MSC能有效调控肺泡上皮的生长，人胚肺MSC及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗COPD、病毒性肺炎造成的肺损伤提供新的生物治疗方法。由于肺部结构的复杂性,干细胞的应用研究进展落后于其他器官。对肺组织损伤修复有关的干细胞研究有助于推动以细胞治疗为基础的肺损伤治疗新方法的发展。

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