慢性间歇低氧对幼鼠海马神经细胞凋亡及caspase-12表达的影响

　　作者：高原1，李源1，3，蔡晓红1，周永海2，张存雪1，4，李宁1，5 作者单位：(温州医学院附属育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.呼吸科;2.儿童保健科;3.郑州人民医院 儿科，河南 郑州 450000;4.济宁市第一人民医院 儿科，山东 济宁 272111;5.深圳市妇幼保健院 儿科，广东 深圳 518000)

　　【摘要】 目的 ：探讨慢性间歇低氧对幼鼠海马神经细胞凋亡及caspase-12表达的影响。方法：取体重为80～100 g健康雄性SPF级SD幼鼠(3～4周龄)40只，随机分为间歇低氧2周(2IH)组、4周(4IH)组，空气对照2周(2C)组、4周(4C)组，每组10只。以间歇低氧舱建立慢性间歇低氧幼鼠模型。采用TUNEL法检测海马神经细胞凋亡，RT-PCR检测海马区caspase-12 mRNA表达，免疫组织化学染色检测海马区caspase-12蛋白的表达。结果 ：间歇低氧组凋亡指数(AI)、caspase-12 mRNA及其蛋白表达均高于对照组(均P <0.01);4IH的AI，caspase-12 mRNA及其蛋白表达均高于2IH(均P <0.01)。结论：慢性间歇低氧幼鼠海马神经细胞caspase-12 mRNA及其蛋白表达随间歇低氧时间延长而增加，内质网应激参与慢性间歇低氧幼鼠海马神经细胞凋亡过程。

　　【关键词】 慢性间歇低氧;内质网应激;海马;凋亡;caspase-12

　　Effect of chronic intermittent hypoxia on apoptosis of rat’s hippocampal cells and the expression of caspase-12 in immature rats GAO Yuan*， LI Yuan， CAI Xiao-hong， ZHOU Yong-hai， ZHANG Cun-xue， LI Ning. *Department of Pulmonology，Yuying Children’s Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College， Wenzhou， 325027

　　Abstract: Objective: To explore the effect of chronic intermittent hypoxia on apoptosis of hippocampal cells and the expression of caspase-12 in immature rat’s. Methods: Forty male Sprague- Dawley rats (3～4 week，80～100 g) were randomly divided into four groups: 2-week intermittent hypoxia group (2IH)，4-week intermittent hypoxia group (4IH)，2-week control group with room air(2C) and 4-week control group with room air (4C)， and ten rats in each group. Intermittent hypoxia model was induced by an intermittent hypoxia cabin，the in situ cell apoptosis in the hippocampus was detected with TUNEL staining. The expressions of caspase-12mRNA in the hippocampus were examined with RT-PCR. Immunohistochemical SP method was used to examine the expression of caspase-12 in the hippocampus. Results: Both the apoptosis index (AI) and the expressions of caspase-12 in hippocampus of intermittent hypoxia group were significantly higher than those in control group (P <0.01). Increasing the duration of hypoxic period， 4IH group had significantly higher levels of AI and the expression of caspase-12 than that of 2IH group. Conclusion: The expression of caspase-12 increases significantly and it shows that endoplasmic reticulum stress plays an important role in the course of apoptosis of immature rat’s hippocampal cells induced by chronic intermittent hypoxia.

　　Key words: chronic intermittent hypoxia;endoplasmic reticulum stress;hippocampus; apoptosis;caspase-12

　　阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obst-ructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是儿童的常见病之一，发病率为1%～10%[1]，多见于学龄前儿童。OSAHS对全身各系统均有很大的影响，儿童以神经系统损害致学习记忆障碍危害最大。然而OSAHS引起学习记忆障碍的病理生理机制尚不明确。本实验模拟OSAHS的典型病理生理特征，建立慢性间歇低氧的幼鼠模型，通过不同干预时间(2周、4周)，观察幼鼠海马神经细胞凋亡及凋亡相关因子caspase-12表达的变化，初步探讨慢性间歇低氧幼鼠海马神经细胞凋亡的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料 间歇低氧舱和空气模拟对照舱自制。LKB2088型超薄切片机，TUNEL试剂盒(Roche公司)，梯度PCR仪(Effendorf公司)，RT-PCR试剂盒(Fermentas公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉生物公司)，caspase-12抗体(CST公司)。

　　1.2 动物分组及模型制备 取八臂迷宫训练成功的体重为80～100 g健康雄性SPF级SD幼鼠 (3～4周龄)40只，由温州医学院实验动物中心提供，合格证号为[SYXK(浙)2005-0061]。按随机数字表法分为间歇低氧2周组(2IH组)和4周组(4IH组)，空气对照2周组(2C组)和4周组(4C组)，每组10只。OSAHS动物模型建立参照McGuire[2]、Gozal等[3]方法加以改进，2IH组及4IH组幼鼠置于常压间歇低氧舱内。90 s为1次低氧-复氧循环，以0.3 kPa压力通氮气30 s，停30 s，25 L/min流量通氧气12 s，停18 s，在停止通气阶段由连接的测氧仪分别测间歇低氧舱内的氧浓度高值、低值。低氧时氧浓度控制在7.8%左右，复氧时氧浓度控制在21.0%左右，CO2浓度始终<0.01%，湿度为(50±10)%。每天舱内实验时间为7.5 h。2C组及4C组幼鼠置于同等条件下的空气模拟对照舱，通压缩空气，与间歇低氧舱由同一单机片程控。实验过程中，白天各舱上面均盖厚布，模拟黑夜，使舱内保持黑暗，幼鼠进入睡眠状态。

　　1.3 标本制作 低氧结束次日予戊巴比妥钠(35 mg/kg体重)腹腔注射麻醉，每组随机取1只幼鼠，仰卧固定，剖开胸腔，暴露心脏。将吸有预冷至0～4 ℃生理盐水的针管刺入左心室，剖开右心耳排液，快速灌入100 mL左右的生理盐水，再用200 mL左右预冷为0～4 ℃的4%戊二醛缓慢灌注后迅速取脑，取脑置于冰盘上，快速分离出左、右海马。左侧海马置于液氮迅速冷冻，再放-70 ℃冰箱保存，用于RT-PCR检测。右侧海马放入4%多聚甲醛中固定4 h，依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，5μm厚连续切片，用于细胞凋亡及免疫组化检测。

　　1.4 海马神经细胞凋亡检测 采用原位缺口末端标记(TUNEL)法，按试剂盒提供方法操作。镜检细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。随机计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数。凋亡指数(apoptosis index，AI)以凋亡细胞/100个细胞(%)表示。

　　1.5 海马区神经细胞caspase-12免疫组化表达 按照试剂盒说明书进行操作。在光学显微镜(40×10倍)下每张切片随机观察6个视野，利用Image-Pro Plus 6.0生物图像处理系统处理检测累积光密度(integrated optical density，IOD)，取平均值作为caspase-12相对含量。

　　1.6 海马区caspase-12基因RT-PCR检测 引物根据Genebank资料，利用primer 5.0引物设计软件确定最优引物，然后经Blast匹对，由上海生工生物有限公司合成。引物：上游5’-GCCC TCATCATCTGCAACAA-3’下游5’-GACGGCCAGC AAACTTCATT-3’扩增片段172 bp，以看家基因GAPDH为内参照，进行RT-PCR反应，反应产物1%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，图像分析仪成像，并进行半定量分析。

　　1.7 统计学处理方法 组间比较采用单因素方差分析，方差齐者用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane’s T2检验。

　　2 结果

　　2.1 海马神经细胞凋亡指数 2C组与4C组可见少许凋亡细胞(见图1)，两组间差异无显著性，2IH与4IH组凋亡细胞较2C组和4C组明显增多(均P <0.01)，4IH组凋亡细胞较2IH组增多(P <0.01)(见表1)。

　　2.2 海马区caspase-12 mRNA 2IH组较2C组表达上调(P <0.01)，4IH组较4C组表达上调(P <0.01)，4IH组较2IH组表达上调(P <0.01)。2C组与4C组表达差异无显著性(P >0.05)。见图3、表1。

　　2.3 免疫组织化学检测显示 海马神经细胞caspase-12免疫反应的产物呈棕黄色，主要表达于细胞胞浆，2C组与4C组可见散在神经细胞表达caspase-12，两组间蛋白表达差异无显著性(P >0.05)，2IH组与4IH组可见较多神经细胞表达caspase-12，4IH组累计光密度(IOD)较2IH组增高(P <0.01)。见图2、表1。

　　3 讨论

　　OSAHS特征性的低氧方式是慢性间歇低氧，这种低氧-复氧方式出现类似缺血/再灌注过程中的病理变化，导致脑损伤及海马等处神经细胞凋亡[4]。我们前期实验已证实慢性间歇低氧幼鼠海马神经细胞电镜下出现明显的超微结构改变，提示细胞凋亡存在[5]，细胞内有精细复杂的途径调控细胞凋亡过程，包括细胞内活性基因、酶和信号转导途径[6]。目前已知有3条主要的信号转导通路来调控细胞凋亡：线粒体通路、死亡受体通路及内质网应激通路，其中内质网应激通路是近年来发现的一条新的细胞凋亡通路[7]，称为内质网相关性死亡(ER-associated death，ERAD)途径。ERAD途径包含内质网应激诱导转录C/EBP的同源蛋白(C/EBP homologus protein，CHOP)、基因表达c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的活化和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(caspase-12)蛋白水解酶的活化[8]。位于内质网侧的caspase-12这条凋亡通路是内质网特异性的。当内质网应激发生时，caspase-12酶活性升高，然后活化的caspase-12从内质网转运到胞浆，最终激活caspase-3等，最后引发细胞凋亡[9]。本实验通过TUNEL检测发现海马神经细胞凋亡的数量随着慢性间歇低氧时间的延长而增加，说明慢性间歇低氧环境下，海马神经细胞的凋亡存在时间依赖性。本实验显示，慢性间歇低氧幼鼠海马区caspase-12 mRNA及蛋白表达较对照组均明显增高，且随着间歇低氧时间的延长明显增高，说明caspase-12介导的内质网应激信号通路参与了幼鼠慢性间歇低氧海马神经细胞凋亡的调控。

　　【参考文献】

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