芹菜素对慢性间歇低氧幼鼠认知损害的保护作用

　　作者：张存雪 作者单位：温州医学院附属育英儿童医院 呼吸科，浙江 温州 325027

　　【摘要】 目的:研究芹菜素对慢性间歇低氧幼鼠认知损害的保护作用。方法:八臂迷宫训练成功的3～4周龄雄性SD幼鼠40只，随机分空气对照组(C组)、间歇低氧组(H组)、间歇低氧二甲基亚砜组(R组)、间歇低氧芹菜素+二甲基亚砜组(Q组)。间歇低氧2周后八臂迷宫测试全部幼鼠学习记忆能力。以透射电镜观察海马CA1区神经元的超微结构变化。结果:与R组比，Q组参考记忆错误(RME)和总记忆错误(TE)显著降低(P<0.05，P<0.01)。与C组比，H组RME、工作记忆错误(WME)和TE显著增高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。电镜下H组和R组海马CA1区神经细胞的形态、胞浆内的细胞器与正常细胞比较有明显变化，Q组和C组无明显变化。结论:芹菜素对于慢性间歇低氧幼鼠海马神经元具有保护作用，从而减轻慢性间歇低氧对幼鼠空间学习记忆能力的损伤。

　　【关键词】 慢性间歇低氧 芹菜素 记忆 海马 超微结构

　　Protective function of apigenin on the damage of congnition in immatcore rats with chronic intermittent hypoxia. ZHANG Cun-xue, CAI Xiao-hong, CAO Shu-yan，ZHOU Yong-hai. Department of Respiratory Medicine，Yuying Children's Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325027.

　　Abstract: Objective: To explore the protective effect of apigenin in immature rats treated with chronic intermittent hypoxia. Methods: Forty 3～4 week-old SD rats which have been trained to complete the 8-Arm (4-arm baited) radial maze were randomly divided into air control(C) group, intermittent hypoxia(H) group, DMSO control(R) group and apigenin + DMSO(Q) group. After 2 weeks intermittent hypoxia, these immature rats were tested by 8-Arm (4-arm baited) radial maze to measure spatial memory and the ultrastructure of hippocampal CAl neurons was studied under electron microscope. Results: Compared with R group, Q group had significantly less in reference memory error and total memory error (P<0.05, P<0.01).Compared with C group, H group had significantly reference，working and total memory error, respectively(P<0.01, P<0.05, P<0.01).The nuclear membrane of hippocampal CAl neurons in H group and R group were distorted compared with normal cells; Q group and C group had no changes. Conclusion: Apigenin protects hippocampal neuron in immature rats, and improves spatial learning and memory damaged by chronic intermittent hypoxia.

　　Key words: chronic intermittent hypoxia; apigenin; memory; hippocampus; ultrastructure

　　芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，有研究显示芹菜素对氧自由基、NO自由基等均有一定的清除作用，可抑制导致细胞死亡的氧化作用,从而体现了神经保护的作用[1]。但其应用于防治阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAHS)儿童认知损害方面的报道较少。本试验模拟OSAHS的病理生理基础，建立慢性间歇低氧的幼鼠模型，并用芹菜素进行干预，采用八臂迷宫测试其学习记忆能力，以透射电镜观察海马的神经细胞超微结构，观察芹菜素干预慢性间歇低氧幼鼠认知损害的效果并探讨可能的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物与药品 取体重为80～100 g健康雄性SPF级SD幼鼠(3～4周龄)50只，由温州医学院实验动物中心提供，合格证号：SYXK(浙)2005-0061。芹菜素纯度98%，批号：060313(购自陕西慧科植物开发有限公司);二甲基亚砜批号：040602(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。芹菜素配制方法：25 mg芹菜素+8 ml生理盐水+40μl DMSO，配成11.6×10-3μmol/L，于4 ℃冰箱保存;溶剂配制方法：8 ml生理盐水+40μl DMSO，配成0.5%的溶剂，4 ℃冰箱保存。

　　1.2 仪器 CYES-Ⅱ型氧、二氧化碳气体测定仪由上海嘉定学联仪表厂提供;间歇低氧舱和空气模拟对照舱自制(主体由不锈钢制成，舱盖中间部分为玻璃;气体钢瓶、减压阀、流量计、控制程序、继电器、电磁阀、显示器等组成控制系统,间歇低氧舱125 cm×48 cm×24 cm大小，侧壁上有4个进气的单向阀，4个排气的单向阀，空气模拟对照舱大小60 cm×48 cm×24 cm大小，侧壁上有2个进气的单向阀，2个排气的单向阀)，电磁阀由宁波亚德客自动化工业有限公司提供，单片机选用台湾华邦(Winbond)的W78E516B八位单片机，医用压缩氧气(浓度>99.5%)和压缩高纯度氮气(浓度>99.99%)由温州市医用氧厂提供;LKB2088型超薄切片机、H-7500型透射电镜由日本日立公司提供，八臂迷宫由温州医学院第二附属医院麻醉科自制，迷宫距地面高40 cm，中间八边形平台直径30 cm，向四周以等角度和等长度延伸八条臂(50 cm×12 cm，围以40 cm高的墙，在每个臂的顶端有一个强化用的食物杯，直径2 cm，深1 cm);迷宫用饲饵由浙江大学医学院药理学教研室提供。

　　1.3 八臂迷宫试验 在放迷宫的房间四周安放一些明显的视觉标志。训练前先将50只幼鼠饿至原体重的85%左右，训练时早晚各给2粒和3粒饲料，在训练过程中保持该体重。然后在迷宫中适应2 d，每天训练一次，适应时2只幼鼠同时置于迷宫中，自由活动和摄取饲饵15 min。每次八臂迷宫的试验时间控制在5 min内，如果超出5 min当作训练不成功，第二天接着训练，每天训练2次，如果在10 d内还不行达到训练成功的标准，就淘汰出试验组。本实验参照Huang YW等[2]方法进行训练。连续5次训练错误选择次数为1次或1次以下，同时WME必须为零，认为训练成功，10 d后成功40只。

　　1.4 动物模型建立及分组 参照McGuire M、Gozal D等[3，4]方法建立慢性OSAHS动物模型。取迷宫训练成功幼鼠40只，随机分为C组、H组、R组和Q组，每组各10只。H、R、Q组置于常压间歇低氧舱内。90 s为一次低氧-复氧循环，以0.3 kPa压力通氮气30 s、停30 s，25 L/min流量通氧气12 s、停18 s，在停止通气阶段由连接的测氧仪分别测间歇低氧舱内的氧浓度高值、低值和二氧化碳浓度。低氧时氧浓度控制在7.8%左右，复氧时氧浓度控制在21.0%左右，CO2浓度始终<0.01%，湿度为(50±10)%。每天7.5 h(8:50～16:20)。C组幼鼠置于同等条件下的空气模拟对照舱，通压缩空气，与间歇低氧舱由同一单片机程。Q组幼鼠每天于常压低氧前30 min腹腔注射25 mg/kg[5]用二甲基亚砜溶解的芹菜素(这个剂量不会影响幼鼠一般的活动能力，可以更客观地评价该药对幼鼠运动行为的影响)。R组则注射同量二甲基亚砜+生理盐水。幼鼠自由活动，不限饮食，实验时间为2周。

　　实验过程中，白天各舱上面均盖厚布，使舱内保持黑暗，模拟黑夜，幼鼠进入睡眠状态。每天间歇低氧结束后，幼鼠出舱，置于日光灯下，模拟白天，自由活动，饮食不限。试验结束前使幼鼠保持饥饿状态，低氧结束当日迷宫测试，整个测定过程同训练过程一致。

　　1.5 标本制备 低氧结束次日，予戊巴比妥钠(35 mg/kg体重，i.p.)麻醉，每组随机取1只幼鼠，仰卧固定，剖开胸腔，暴露心脏。将吸有预冷至0～4 ℃生理盐水的针管刺入左心室，剖开右心耳排液，快速灌入100 ml左右的生理盐水, 再用200 ml左右预冷为0～4 ℃的4%戊二醛缓慢灌注后迅速取脑，以常规电镜程序制作标本，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，Epon812包埋，LKB2088型超薄切片机切片，经铅-铀双重染色，H-7500型透射电镜观察。

　　1.6 统计学处理方法 采用单因素方差分析，方差齐者组间比较用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane's T2检验

　　2 结果

　　2.1 芹菜素对慢性间歇低氧幼鼠认知损害的影响 与R组比，Q组RME和TE显著降低(P<0.05，P<0.01);与C组比，H组RME、WME和TE显著增高(P<0.01，P<0.05，P<0.01);Q组和C组、H组和R组比较，RME、WME和TE差别无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

　　2.2 海马CA1区超微结构 透射电镜观察，H组神经细胞核膜变模糊、深染、轻度固缩，出现超微结构改变;而C组具有正常的神经元、核膜清晰，没有明显改变;R组核膜模糊、边界不清，胞质无改变，染色质颜色变深;而Q组神经元、核膜基本正常(见图1)。

　　3 讨论

　　芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，有“植物雌激素”之称，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中。研究发现，芹菜素有神经保护、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等广泛的药理作用。Patil CS等[6]研究发现，芹菜素能改善衰老和脂多糖导致的认知损害。本实验运用放射状八臂迷宫测定幼鼠空间记忆能力发现：芹菜素可避免慢性间歇低氧导致的幼鼠空间学习记忆损害，具有重要的神经元保护作用。慢性间歇低氧类似缺血再灌注损伤，导致机体氧化应激，使得活性氧(ROS)过量生成，引发线粒体介导的神经细胞凋亡[7]。我们运用透射电镜观察到间歇低氧组和溶剂对照组海马CA1区神经细胞核出现超微结构改变。袁颖等[8]发现低氧-复氧后凋亡海马神经元百分率明显增多。芹菜素是一种很强的金属离子螯合剂，它可以通过螯合作用降低金属离子参与的自由基反应，减少氧自由基的生成，并对氧自由基、NO自由基等有一定的清除作用，从而能减少氧化应激损伤。Sugihara N等[9]研究证实芹菜素对铁依赖脂质过氧化反应有明显的抑制作用。Singh JP等[10]连续2周给大鼠注射25 mg/kg剂量的芹菜素，发现体内的脂质过氧化产物(LPO)水平接近正常水平，从而阻断致癌物所致的氧化应激。本研究发现芹菜素组海马超微结构未发生明显改变，因此，我们推测芹菜素对海马CA1区神经元的保护作用可能与其对自由基的清除、抑制氧化应激有关。

　　【参考文献】

　　[1] Sugihara N,Arakawa T,Ohnishi M, et al. Anti- and pro-oxi-dative effects of flavonoids on metal-induced lipid hydrop- eroxide-dependent lipid peroxidation in cultured hepato- cytes loaded with alpha-linolenic acid[J].Free Radic Biol Med, 1999,27 (11-12):1313-1323.

　　[2] Huang YW, Chen Z, Hu WW, et al. Facilitating effect of histamine on spatial memory deficits induced by dizocilpine as evaluated by 8-arm radial maze in SD rats [J]. Acta Pharmacol Sin,2003 ,24(12):1270-1276.

　　[3] McGuire M, MacDermott M, Bradford A. The effects of chronic episodic hypercapnic hypoxia on rat upper airway muscle contractile properties and fiber-type distribution [J]. Chest, 2002,122(4):1400-1406.

　　[4] Gozal D, Daniel JM, Dohanich GP. Behavioral and anatomical correlates of chronic episodic hypoxia during sleep in the rat[J]. J Neurosci,2001,21(7):2442-2450.

　　[5] Nakazawa T, Yasuda T, Ueda J, et al. Antidepressant-like effects of apigenin and 2,4,5-trimethoxycinnamic acid from Perilla frutescens in the forced swimming test[J]. Biol Pharm Bull, 2003,26(4):474-480.

　　[6] Patil CS, Singh VP, Satyanarayan PS, et al.Protective effect of flavonoids against aging- and lipopolysaccharide-induced cognitive impairment in mice[J].Pharmacology, 2003,69(2):59-67.

　　[7] Xu W,Chi L,Row BW ,et al. Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea[J]. Neuroscience, 2004,126(2):313-323.

　　[8] 袁颖,沈卫星,张沛云，等.缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元凋亡和一氧化氮合酶表达变化及银杏叶提取物的作用[J]. 中国临床药理学与治疗学,2005,10(9):996-1000.

　　[9] Sugihara N, Arakawa T, OhnishiM, et al. Anti- and pro-oxidative effects of flavonoids on metal-induced lipid hy- droperoxide-dependent lipid peroxidation in cultured hepa-tocytes loaded with alpha-linolenic acid[J]. Free Radic Biol Med, 1999, 27 (11-12) : 1313-1323.

　　[10]Singh JP, Selvendiran K, Banu SM,et al.Protective role of Apigenin on the status of lipid peroxidation and antioxidant defense against hepatocarcinogenesis in Wistar albino rats [J]. Phytomedicine,2004, 11(4): 309-314.