低氧肺动脉高压大鼠的肺动脉组织凋亡

　　作者：刘婷 李运成 钱桂生 张志远 杨昱 王关嵩 作者单位：第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037

　　【摘要】 目的 研究bcl2、bax凋亡相关基因在低氧处理大鼠肺动脉中的表达，探讨低氧肺动脉高压的发病机制及防治措施。方法 36只Wistar大鼠随机分为3组，分别为正常对照组、低氧肺动脉高压组、低浓度一氧化碳(CO)组，每组12只，采用原位细胞凋亡、原位杂交、免疫组化等方法检测肺动脉的凋亡状况。结果 ①原位凋亡检测示，正常对照组、低氧肺动脉高压组、低浓度CO组的凋亡率分别为8.1%，37.6%，76.5%，三者间差异显著;②原位杂交显示，正常对照组bax、bcl2杂交呈弱阳性表达。低氧肺动脉高压组bax杂交呈弱阳性表达，低浓度CO组呈强阳性表达，但bcl2杂交可见低氧肺动脉高压组呈强阳性表达，低浓度CO组呈弱阳性表达;③免疫组织化结果表明，低浓度CO组bcl2、bax蛋白均有升高，以bax为著。低氧肺动脉高压组虽然也有表达，但程度较弱，且bcl2表达处于优势。结论 低浓度CO可以调节bcl2、bax凋亡基因的表达，从而促进肺动脉组织的凋亡。

　　【关键词】 低氧;肺动脉高压;凋亡

　　肺动脉高压(PH)病因复杂，可由多种心、肺或肺血管疾病引起。肺血管重建被认为是低氧肺动脉高压的主要病理变化〔1〕，肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖可能是导致PH形成的重要环节，增加平滑肌细胞凋亡可以逆转PH肺血管重建〔2〕。在bcl2基因家族中，bcl2是凋亡抑制基因，bax是凋亡诱导基因，二者比率是影响细胞凋亡的关键。以往体外研究〔2〕发现，低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞的增殖，而低浓度CO可以部分抑制低氧对肺动脉平滑肌细胞的作用。为深入探讨其机制，本研究利用全自动缺氧舱复制低氧性PH大鼠模型，分别给予常氧、低氧、低氧与低浓度CO处理，观察肺动脉bcl2、bax基因的变化，探讨PH发病机制，为其防治提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 低氧PH大鼠模型制备及处理分组

　　选择健康成年雄性Wistar大鼠36只，体重(200±25)g (购自第三军医大学实验动物中心)，随机分为3组，每组12只。正常对照组：放在室温下依常规方法饲养;低氧PH组：依我所方法建常压低氧仓，保持O2浓度为(10±0.5)%，每天7 h，每周6 d，周日休息，持续3 w;低浓度CO组：每日低氧2 h后通入1次调制好的2 μmol/L的CO 15 min。

　　1.2 原位细胞凋亡检测

　　参照试剂盒说明书方法略加修改。先用PBS (pH 7.4) 漂洗组织切片，然后4% PFA固定组织切片30 min;室温下0.3% H2O2封闭15 min，PBS漂洗2×3 min;0.1% TritonX100 4℃通透10 min，PBS漂洗2×3 min;加入由末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)，脱氧三磷酸核苷 (dNTP) 和荧光素标记的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)组成的混合液30 μl，37℃反应1 h，荧光显微镜下观察并照相;加入过氧化物酶(POD)连接的抗荧光素抗体20 μl，37℃反应30 min，PBS漂洗3×5 min;滴加新配制的0.01%H2O2/0.05%DAB显色液，显微镜下观察，显色约10 min左右，清水冲洗终止反应;苏木素轻度复染，常规系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜高倍镜下，观察5～8个视野，计数200个细胞以上，计算阳性细胞百分率。

　　1.3 原位杂交检测

　　参照文献〔3〕方法，所需试剂和器械均经DEPC水处理。取实验组及对照组动物肺动脉组织，基本过程如下：切片在0.1 mol/L PBS (pH 7.2，下同)中漂洗5 min×3，再2×SSC漂洗10 min;蛋白酶K (20 μg/ml，Merck产品) 消化，37℃孵育5 min;0.1 mol/L甘氨酸/0.1 mol/L PBS漂洗5 min;4%多聚甲醛漂洗5 min;0.1 mol/L PBS漂洗5 min×3，再2×SSC漂洗10 min;预杂交后置42℃水浴中2 h;在每张片子上加20 μl地高辛标记探针杂交液，用DEPC水处理的膜覆盖，于湿盒中42℃孵育20 h;取出切片，去膜，4×SSC及PBS充分漂洗;滴加AntiDigAp抗体;NBT/BCIP室温避光显色4～6 h;0.05 mol/L PBS充分漂洗，终止显色反应;中性树胶封片。原位杂交染色结果的判定，以细胞浆和胞膜内出现明确的紫蓝色细颗粒为阳性染色。无阳性信号(-);弱阳性(+)，阳性细胞≤25%;弱阳性()，阳性细胞26%～50%;强阳性 ()，阳性细胞51%～75%;强阳性()，阳性细胞>75%。

　　1.4 免疫组织化学

　　所用的抗体bcl2为兔抗人单克隆抗体，购自加美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶50;bax为兔抗人多克隆抗体，购自加美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶30;生物素标记的二抗为羊抗兔多克隆抗体，购自武汉博士德公司，工作浓度1∶200。具体方法参见〔4〕。结果判定：背景无颜色，胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。无阳性信号(-);弱阳性(+)，阳性细胞≤25%;弱阳性()，阳性细胞25%～50%;强阳性()，阳性细胞50%～75%;强阳性()，阳性细胞>75%。

　　1.5 统计学分析

　　实验结果应用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，组间率的比较用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 原位凋亡结果

　　荧光显微镜下可见低浓度CO组肺动脉组织有明显的凋亡标记，而常氧组仅见很弱的荧光。正常对照组、低氧肺动脉高压组、低浓度CO组的阳性率分别为8.1%，37.6%，76.5%三者差异显著(P<0.01 )，见图1。

　　2.2 原位杂交检测结果

　　bax、bcl2 mRNA阳性细胞细胞浆和细胞膜着紫蓝色颗粒，均匀着色，阳性细胞呈不均匀分布。正常对照组bax、bcl2杂交呈微弱的紫蓝色，为弱阳性表达(+)。低氧PH组bax杂交呈中等强度的紫蓝色，为弱阳性表达()，低浓度CO组呈极强的紫蓝色，为强阳性表达();但bcl2杂交,可见低氧PH组细胞胞浆呈强的紫蓝色，为强阳性表达()，低浓度CO组呈微弱的紫蓝色，为弱阳性表达(+)，见图2。

　　2.3 免疫组织化学染色的情况

　　结果表明，正常对照组免疫组织化学染色bcl2、bax均很弱;低浓度CO组bcl2、bax均有升高，以bax为著 (78.9%)，与低氧PH组比较有显著差异(P<0.01);低氧PH组bax虽然也有表达，但程度较弱，且bcl2表达处于优势(80.0%)，与低浓度CO组比较有显著差异(P<0.01)。肺动脉凋亡主要发生在内皮细胞和平滑肌细胞，见图2、表1、表2。表1 各组大鼠肺动脉bcl2凋亡的蛋白质表达情况，表2 各组大鼠肺动脉bax凋亡的蛋白质表达情况(略)。

　　3 讨论

　　近年来，随着细胞凋亡在肺动脉高压研究中的不断深入，人们已经注意到肺动脉高压时，肺组织细胞可以细胞凋亡方式出现，并在发病中起到一定作用。bcl2被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一，其属于跨膜蛋白，主要分布于核膜、线粒体膜和内质网膜上。bcl2和bax同属于bcl2家族，但二者功能相反，bcl2抑制凋亡的促进增殖，而bax促进细胞凋亡〔5〕。一般认为bcl2通过控制细胞核内外物质的运输和抑制Ca2+的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而发挥抗凋亡作用。而bax作为bcl2的同源体，其作用是抑制bcl2作用，其与bcl2基因一样在组织广泛表达。bax与bcl2在细胞中的比例决定细胞是否发生凋亡，bax过量时，形成baxbax同二聚体，诱导细胞凋亡;bcl2过量时，形成bcl2异二聚体，抑制细胞凋亡〔6〕。机体在正常情况下bax与bcl2的处于平衡状态，低氧或CO诱导情况下这种平衡往往被打破，使bax或 bcl2处于优势地位，从而表现为凋亡或增殖。但是，外界因素对二者的影响非常复杂，同一因素对不同组织细胞的影向不尽相同〔7，8〕。本研究中低氧处理后肺动脉的bcl2基因表达水平显著升高，bcl2蛋白质含量增加，而bax mRNA和蛋白质表达水平稍微升高，bcl2的基因表达处于优势地位，这与以往的研究相一致〔9〕。可能的机制是形成了bax/bcl2异二聚体，从而抑制凋亡促进增殖。低浓度CO作用后，肺动脉的bcl2表达有所下降，bax显著上升，说明低浓度CO可能通过上调bax，使其处于优势地位，进而形成baxbax同二聚体，促进肺动脉组织的凋亡〔10〕。

　　以往研究表明增殖和凋亡现象共存在于低氧PH大鼠的肺血管细胞中〔11〕，也许bcl2和bax等基因的异常表达导致了细胞增殖和凋亡的失衡，进而调节了慢性低氧肺血管结构的改建。本实验通过bcl2家族两类功能相反基因bcl2和bax的研究，提示bcl2和bax表达可能参与了肺动脉组织的凋亡，bcl2和bax基因在低氧肺动脉表达程度对于评估PH患者的预后及指导临床治疗有一定意义。bax/bcl2对PH的调控非常复杂，许多问题有待探讨，但利用多种手段在某一环节给予干预，下调bcl2或增强bax表达，将为PH治疗开拓新思路。

　　【参考文献】

　　1 Mclaughlin VV，Mc Goon MD.Pulmonary arterial hypertension〔J〕. Circulation，2006;114(13)：141731.

　　2 Mc Murtry MS，Bonnet S，Wu X,et al.Dichloroacetate prevents and reverses pulmonary hypertension by inducing pulmonary artery smooth muscle cell apoptosis〔J〕.Circ Res，2004;95(8)：83040.

　　3 郑晓飞主编.RNA实验技术手册〔M〕.北京：科学出版社，2004：1517.

　　4 王关嵩，钱桂生，杨晓静，等.一氧化碳对大鼠血管平滑肌细胞低氧性增殖反应的作用〔J〕.中国病理生理杂志，2000;16(2)：1179.

　　5 Karbowski M，Norris KL，Cleland MM,et al.Role of Bax and Bak in mitochondrial morphogenesis〔J〕.Nature，2006;443(7112)：65862.

　　6 Shore GC，Nguyen M.Bcl2 proteins and apoptosis：choose your partner〔J〕.Cell，2008;135(6)：10046.

　　7 Nakao A，Kimizuka K，Stolz DB,et al.Carbon monoxide inhalation protects rat intestinal grafts from ischemia/reperfusion injury〔J〕.Am J Pathol,2003;163(4)：158798.

　　8 Wang X，Wang Y，Kim HP,et al.Carbon monoxide protects against hyperoxiainduced endothelial cell apoptosis by inhibiting reactive oxygen species formation〔J〕.J Biol Chem，2007;282(3)：171826.

　　9 Togane Y，Morita T，Suematsu M,et al.Protective roles of endogenous carbon monoxide in neointimal development elicited by arterial injury〔J〕. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000;278(2)：H62332.

　　10 Wang X，Wang Y，Kim HP,et al.Carbon monoxide modulates fas/fas ligand，caspases，and Bcl2 family proteins via the p38α mitogenactivated protein kinase pathway during ischemiareperfusion lung injur〔J〕.J Biol Chem，2003;278(24)：2206170.

　　11 王关嵩,钱 频,蔡文琴，等.CO作用后大鼠肺血管细胞增殖和凋亡状况的研究〔J〕.第三军医大学学报，2002;24(1)：668.