鞣酸对LLC/cMOAT细胞多药耐药性的逆转机制
发表时间：2010-04-19 浏览次数：481次
作者：蒋旭琴,包明红,梅晓冬 作者单位：合肥，安徽医科大学附属省立医院呼吸内科
【摘要】 目的 本研究探讨鞣酸(Tannic acid,TA)对LLC/cMOAT细胞多药耐药性的逆转作用及其可能机制。方法 采用MTT法检测LLC/CMV和LLC/cMOAT细胞对各种化疗药物的敏感性以及在不同浓度的TA处理下细胞的存活状态;确定TA的非细胞毒性浓度以及在该浓度下各梯度浓度处理时细胞的存活率;采用流式细胞仪技术检测使用非细胞毒性浓度的TA处理前后LLC/cMOAT细胞内柔红霉素(DNR)浓度变化、细胞周期阻滞及对凋亡的影响。结果 LLC/cMOAT细胞对羟基喜树碱(CPT11)，阿霉素(ADM)，顺铂(DDP)和长春新碱(VCR )均有不同程度的耐药，其耐药倍数分别是2.08、3.02、4.01和9.31，对依托泊苷(VP16)、紫衫醇(TAX)无明显耐药，10.0μmol/L浓度以下的TA对LLC/CMV和LLC/cMOAT细胞无明显细胞毒性，2.5、5.0、10.0 μmol/L浓度的TA能显著降低LLC/cMOAT细胞的IC50(P<0.05)，其逆转倍数分别为5.09、6.33、7.76倍;细胞内DNR荧光强度随着TA浓度的增高而明显增强;TA作用细胞12h可使G1期细胞数百分比由(46.35±3.74)%增至(66.43±5.87)%, 阻滞细胞于G1期;TA与VCR联合处理细胞24h和48h时凋亡率分别为12.1%和19.0%，与处理前(1.65%)相比提高明显;使用2.5μmol/L、5.0μmol/L和10.0μmol/L浓度的TA与VCR共同处理细胞24h后，凋亡率由处理前的4.96%分别提高到11.2%、17.9%和25.1%。结论 TA能部分逆转LLC/cMOAT细胞的多药耐药，显著提高耐药细胞内DNR荧光强度并呈浓度依赖性，阻滞细胞周期于G1期，并可诱导细胞凋亡，呈时间、剂量依赖性，其机制可能与抑制化疗药物外排、增加细胞内药物浓度以及诱导细胞凋亡有关。
【关键词】 鞣酸;cMOAT;多药耐药;逆转;细胞凋亡
Reversal Mechanism of Tannic Acid on Multidrug Resistant of LLC/cMOAT Cells
JIANG Xuqin, BAO Minghong, MEI Xiaodong
Department of Respiratory Medicine，Anhui Provincial Hospital Affiliated To Anhui Medical University,Hefei 230001,China
Corresponding Author: MEI Xiaodong,Email:hfmxd@sina.comAbstract：Objective To investigate the reversal effects of tannic acid(TA) on the multidrug resistance of LLC/cMOAT cells and the possible mechanism.Methods MTT assay was used to determine the sensitivity of LLC/CMV and LLC/cMOAT cells to the various kinds of chemotherapeutics，and the activity of LLC/CMV and LLC/cMOAT cells treated with different concentrations of TA. The noncytotoxic concentrations of TA were determined for the cells and the reversal effects of the chemotherapeutics were observed. The intracellular concentration of DNR, the cell cycle distribution and the apoptosis rate of the cells treated with different concentrations of TA were determined by flow cytometry(FCM).Results LLC/cMOAT cells were resistant to CPT11，ADM，DDP，VCR to a certain extent, and not resistant to VP16、TAX. At 10.0μmol/L and below，TA was not significantly cytotoxic to LLC/CMV and LLC/cMOAT cells. TA at the concentration of 2.5，5.0，10.0μmol/L may remarkably decrease IC50 of LLC/cMOAT cells(P<0.05). The intracellular DNR fluorescence intensity in LLC/cMOAT cells was significantly enhanced with the increase of TA concentration. The cells at G1 stage increased from (46.35±3.74)% to (66.43±5.87)% when treated with TA at 5.0 μmol/L for 12 hours. The cell apoptosis was enhanced in a timeand concentrationdependent manner by treating with TA.Conclusion TA is able to reverse the multidrug resistance of LLC/cMOAT cells and may remarkably raise drug concentrations in concentrationdependent manner,TA is able to block cell cycle at G1 stage,and its function of inducing apoptosis acts in timeand dosedepended manner.The mechanism may involve the decrease of chemotherapeutics excretion,the increase of intracellular drug concentration, growth arrest at G1 and apoptosis.
Key words：Tannic acid; cMOAT; Multidrug resistance;Reversal; Apoptosis
0 引言
多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指肿瘤患者接受化疗后，不仅对该药产生耐药性，而且对其他结构和功能不同的药物也产生交叉耐药。如何克服MDR是目前肿瘤防治研究的重要领域之一。目前已知产生MDR的主要机制有MDR1(Pglycoprotein Pgp)、MRP(multidrug resistanceassociated protein，MRP)和LRP(lung resistance protein，LRP)基因及其编码的蛋白过度表达，GSTπ解毒系统活性的增高，DNA 损伤修复功能的改变，细胞凋亡抑制等。其中多药耐药相关蛋白(multidrug resistance -associated protein，MRP)与化疗耐药的关系倍受重视。MRP 的同源基因有MRP1～MRP9等,现均已被克隆。其中MRP2是继MRP1后另一个重要的与MDR有关的蛋白[12]。鞣酸是一类比较复杂的多元酚类化合物，广泛存在于植物界，有报道称其具有化疗增敏作用[3]，本研究探讨了TA对转染人MRP2 cDNA的细胞株LLC/cMOAT多药耐药的逆转作用及其机制，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞
LLC/CMV、LLC/cMOAT细胞均由日本鹿儿岛大学医学院肿瘤研究所古川博士馈赠。
1.2 药品与试剂
新生胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640培养基购自Gibco公司。青霉素、链霉素购自华北制药股份有限公司。胰蛋白酶为粉剂,购自Gibco公司。二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶等均为Sigma公司产品。DDP购自山东齐鲁制药厂。VCR购自上海华联制药有限公司。ADM购自浙江海正药业。VP16 、TAX为江苏恒瑞制药厂产品; CPT11为海南卫康药业有限公司产品。TA药用粉剂，为遵义市林源化工有限责任公司产品。
1.3 方法
1.3.1 细胞系及培养条件 LLC/CMV、LLC/cMOAT细胞分别为LLCPK1(猪近端肾小管上皮细胞)转染空的载体和人的MRP2cDNA得到的二株稳定细胞株。用含10%胎牛血清(100u/ml青霉素、100u/ml链霉素)的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2条件下培养。细胞传代用含0.25%胰蛋白酶液消化。选取对数生长期细胞进行实验。
1.3.2 MTT快速比色法试验 将处于对数生长期的LLC/cMOAT，LLC/CMV细胞的细胞数调整至3×104/ml，取96孔板每孔加入200μl细胞悬液，置37℃、5%CO2培养箱过夜。去掉培养基，分别加入上述六种化疗药物200μl。化疗药物作用浓度 (μmol/L)按照实验要求设置倍增浓度的各抗肿瘤药物(根据各药物临床血药浓度确定，本实验在血药峰浓度的0.01～100倍之间设立7个浓度级)及逆转剂TA(根据TA的细胞毒性确定各自的浓度)，每种浓度设6个复孔，同时设不加细胞、只加各药的空白对照，以及只加细胞不加任何药物的阴性对照。继续在96孔板中培养72h。每孔板加入20μlMTT(5mg/ml), 4h后终止培养，离心吸弃上清液，每孔加150μlDMSO，振荡10min使结晶物充分溶解。由空白孔调零后，以酶标仪检测570nm处光吸收值(OD)。
(1)检测LLC/cMOAT细胞对抗肿瘤药物的耐药性 根据临床用药的血药浓度设计一定的抗肿瘤药物的浓度范围，测定VP16、TAX、VCR、ADM、DDP、CPT11对LLC/CMV、LLC/cMOAT细胞的半数抑制浓度(IC50)，求出LLC/cMOAT细胞对VCR等抗肿瘤药物的耐药倍数。
按下列公式计算抑制率：
抑制率(IR，%)=对照组OD值-实验组OD值/对照组OD值 × 100%
以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制浓度效应曲线，确定IC50。
耐药倍数(RF)=耐药细胞 IC50/ 亲本细胞IC50
(2)确定TA对LLC/CMV和LLC/cMOAT的非细胞毒性浓度 设置不同浓度的TA，观察细胞的存活状态，求出它们的抑制率,从而确定10% IR的TA浓度，选择在此非毒性浓度以下进行药物增敏试验。
(3)TA对LLC/cMOAT多药耐药的逆转 将不同浓度的TA与VCR联合应用，测定细胞对VCR药敏性的改变情况
逆转倍数(RI)= IC50(LLC/cMOAT单用VCR)/IC50(LLC/cMOAT联用TA+VCR)
1.3.3 流式细胞仪(FCM)测定LLC/cMOAT细胞内DNR荧光强度 取对数生长期的细胞，以2×107/L接种到25ml培养瓶中，每瓶5ml;细胞贴壁24h，每一浓度各3瓶，每瓶加入不同浓度的TA 1ml，TA作用24h后每瓶加入DNR(终浓度为2μmol/L) 1ml;DNR作用3h后，收集细胞，冷PBS吹洗3次;1ml冷PBS吹散细胞;按DNR本身发红色荧光的特点，参考Kato等[4]的方法，FCM检测细胞内DNR荧光强度,以DNR荧光强度代表DNR浓度。
1.3.4 PI染色检测细胞周期及凋亡 将不同浓度的TA、VCR、TA与VCR(终浓度为0.4μmol/L)分别加入培养的LLC/cMOAT细胞中，孵育一定时间后取出收集细胞，细胞数约1×106/ml,PBS洗3次，1000r/min离心5min去上清。加入75%的乙醇固定，放入冰盒中送检。上机前准备：PBS洗1次5min;加PI荧光染色液(5mg/L PI,20mg/L RNA酶)于4℃冰箱中放置45min;过夜。300目的筛网过滤1次,记数10000个细胞检测细胞周期及凋亡。
1.4 统计学方法 计量资料用±s表示，两组间均数的比较采用t检验，不同处理组率的比较采用χ2检验，采用SPSS11.0统计分析软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 LLC/cMOAT细胞的多药耐药性
CPT11、ADM、DDP和VCR对LLC/cMOAT的IC50明显较对LLC/CMV细胞的IC50高，差异有统计学意义(P<0.05)。LLC/cMOAT对VP16和TAX均未产生耐药性，见表1。表1 LLC/CMV和LLC/cMOAT对常用化疗药物的
敏感性及耐药程度(n=6)IC50(μmol/L)LLC/CMVLLC/cMOAT耐药倍数VP16 6.364±0.759 7.243±0.7581.14 TAX 4.025±0.372 4.473±0.3851.11 CPT1123.026±4.51247.968±5.3262.08*ADM 1.142±0.215 3.446±0.2733.02*DDP 2.203±0.412 8.841±0.8674.01*VCR 0.035±0.004 0.326±0.0219.31*
*P<0.05与对照细胞LLC/CMV相比。2.2 TA对LLC/CMV和LLC/cMOAT细胞增殖的影响
TA在2.5～10.0μmol/L浓度范围内，对LLC/CMV和LLC/cMOAT细胞无明显细胞毒作用，其IR均<10%，见表2。表2 TA对LLC/CMV和LLC/cMOAT细胞生长
的抑制作用(IR，%，±s，n=6)
TA(μmol/L)LLC/CMVLLC/cMOAT 2.52.06±0.361.87±0.35 5.04.87±0.584.32±0.5010.09.21±0.678.79±0.68
2.3 TA对LLC/cMOAT细胞MDR的逆转作用
TA在2.5～10.0μmol/L浓度范围内无明显细胞毒性作用，但与VCR联合用药时，可使VCR对MDR细胞的IC50下降，且呈剂量非线性依赖性，逆转倍数见表3。TA对敏感株敏感细胞无明显增敏作用。表3 TA对LLC/CMV和LLC/cMOAT细胞VCR 耐药性的逆转(±s,n=6)
TA
(μmol/L)IC50 (μmol/L)逆转倍数LLC/CMVLLC/cMOATLLC/CMVLLC/cMOAT 0 0.033±0.008 0.322±0.019 —— 2.50.031±0.006*0.064±0.007Δ 1.135.09 5.00.029±0.005*0.051±0.005Δ 1.216.3310.00.028±0.007*0.042±0.004Δ 1.257.76
*P>0.05与对照组LLC/CMV比较;ΔP<0.01与对照组LLC/cMOAT比较2.4 TA对LLC/cMOAT细胞内DNR荧光强度的影响
如图1所示LLC/cMOAT细胞内DNR积聚能力较LLC/CMV细胞明显降低，P<0.05。然而，经TA处理后，能明显增加LLC/cMOAT细胞内DNR浓度，P<0.05，且随着TA浓度的提高，其细胞内荧光强度亦逐渐增强，表明TA能增加细胞内DNR药物浓度，且呈浓度依赖性。
2.5 TA对LLC/cMOAT细胞周期的影响
5.0μmol/L TA作用4、8、12h后，发现未有明显的亚二倍体(PreG1)出现;而0、4、8、12h的G1期细胞数增多(%)如表4，说明在未出现明显凋亡之前G1期细胞数呈时间依赖性增多，结果显示TA能阻滞细胞于G0/G1期，S期比例减少，细胞增殖指数明显下降，与对照组比较，各组差异有统计学意义(P<0.05)。
2.6 TA诱导LLC/cMOAT细胞的凋亡
PI染色流式细胞记数显示，2.5μmol/LTA与表4 TA对LLC/cMOAT细胞周期的影响与0hG0/G1比较，P<0.05VCR联用，0、24和48h细胞凋亡率分别为1.65%、12.1%和19.0%，表明TA诱导细胞凋亡呈时间依赖性。0、2.5μmol/L、5.0μmol/L和10.0μmol/LTA与VCR共同处理细胞24h后，其凋亡率分别为4.96%、11.2%、17.9%和25.1%,而对照组细胞24h自然凋亡率为1.98%，显示TA诱导细胞凋亡亦呈浓度依赖性。
3 讨论
MRP2又名cMOAT (the canalicular multispecific organic anion transporter)，是肝细胞膜上一种重要的转运蛋白，其基因编码位于人类10号染色体短臂24带，蛋白相对分子质量为190000，属于ATP结合的盒式蛋白。MRP2在许多正常组织如肝脏、肾脏近曲小管、十二指肠、空肠、胆囊等都有表达;MRP2通过水解ATP酶参与细胞内外物质的转运。其底物主要为一些有机阴离子，包括胆红素和各种谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、巯基的结合物等，具有重要的生理功能。Sandusky GE[5]研究发现MRP2在许多肿瘤组织中如肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等均有表达;MRP2在结肠癌和卵巢癌[68]组织中高表达的同时，在化疗过程中对顺铂的耐药性明显增强。近年来的研究发现MRP2表达特征与恶性肿瘤化疗效果具有密切的关系，阳性或高表达者化疗效果不佳，甚至无效，而阴性或低表达者化疗效果较好。
本实验中使用的LLC/CMV、LLC/cMOAT细胞株，为猪近端肾小管上皮细胞LLCPK1分别转染空的载体和人的MRP2 cDNA建立的一组细胞株。Western blot实验显示，LLC/CMV细胞中无MRP2表达，LLC/cMOAT细胞高表达人MRP2蛋白并对多种抗肿瘤药物表现有不同程度的耐药[9]。本研究结果显示LLC/cMOAT细胞对CPT11、ADM、DDP、VCR有不同程度的耐药性，对VP16、TAX无明显耐药，与研究报道相似[10]。MRP2与多种化疗药物的耐药有关，逆转MRP2相关的耐药可能有助于提高化疗的效果。有研究表明[10]CsA能完全逆转LLC/cMOAT的多药耐药，但由于CSA存在明显的肾毒性及免疫抑制作用而使其临床应用受到限制。目前尚没有能在临床应用的安全有效的逆转药物，因此开发安全有效的逆转剂具有重要的意义。
鞣酸又名单宁酸，是一类比较复杂的多元酚类化合物，广泛存在于植物界，在许多平常的食物如坚果、豆类、葡萄中均发现含有鞣酸;约70%以上的中草药含有鞣质类化合物，如五倍子、地榆、肉桂、大黄、仙鹤草等。它具有多种生物活性，过去应用的多为其收敛性、抗氧化性、抗病毒等，近年来国外研究发现鞣酸具有一定的抗肿瘤活性，能抑制多种肿瘤细胞如胆管癌的生长[11]，抑制肿瘤蛋白酶体活性[12]，进一步诱导肿瘤细胞凋亡[11]。
图2 TA聚合VCR对LLC/cMOAT细胞凋亡的影响
本实验显示鞣酸在2.5～10.0μmol/L浓度范围内对LLC/CMV 和LLC/cMOAT细胞均无明显细胞毒性，且能逆转LLC/cMOAT细胞的多药耐药，对LLC/CMV细胞无明显增敏作用。MRP2是依赖于ATP的药物外排泵，主要通过改变细胞内的药物分布和将药物转移至细胞外，降低细胞内的药物浓度而导致耐药[13]。DNR是亲脂类抗癌药物，在流式细胞仪的激光照射下发红色荧光，荧光强度与浓度相关，检测荧光强度可以反映出细胞内DNR浓度，了解细胞的耐药程度及逆转后的效果。本研究结果显示，与LLC/CMV细胞比较，LLC/cMOAT细胞内DNR积聚能力明显降低。当LLC/cMOAT细胞经鞣酸处理后细胞内DNR浓度明显提高，且呈浓度依赖性，表明TA能增加LLC/cMOAT对DNR的聚集能力。TA可能是通过抑制MRP2的药物外排功能，从而一定程度上恢复化疗药物的敏感性，逆转了细胞的多药耐药。
细胞凋亡是大多数抗肿瘤药物抗肿瘤作用的机制之一。有学者认为具有MDR特性的细胞常显现出凋亡抗性，凋亡抗性可能是MDR的本质之一[14]，肿瘤的发生与细胞凋亡机制减弱有关，诱导肿瘤细胞凋亡可以逆转肿瘤的MDR，提高肿瘤的化疗疗效。本实验结果显示TA能阻断LLC/cMOAT细胞周期，使其停滞于G1期，使G1期细胞数增多，细胞生长受到了抑制，与Kamei H [15] 研究一致;此外，细胞凋亡率随作用浓度的增高而增高，表明TA能诱导LLC/CMV细胞凋亡，呈时间浓度依赖性。
本实验研究表明，TA对LLC/cMOAT细胞有明显的耐药逆转作用，其机制涉及抑制药物外排而影响细胞内药物的积聚、细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡等方面。TA对MRP2蛋白过表达的耐药细胞LLC/cMOAT作用的分子水平的机制以及体内抑癌效果如何有待深入研究。
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