蛋白质组学技术对PC12细胞的热休克蛋白的鉴定

　　作者：张磊 陈秋惠 常明 李红杰 侯澍 朴燕洁 胡林森 作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 使用蛋白质组学技术鉴定大鼠肾上腺皮质细胞瘤细胞系PC12细胞内的热休克蛋白质。方法 提取PC12细胞的蛋白质，建立固相pH梯度双向电泳图谱，应用图像扫描仪及ImageMaster 2D Elite分析软件获得蛋白质点的数字化和匹配性信息，挑选匹配良好的高峰度蛋白点，进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)分析，鉴定。结果 用二维电泳技术分离，并用MALDITOFMS 成功鉴定出5个PC12细胞的热休克蛋白。结论 PC12 细胞蛋白质组中热休克蛋白胶图位点的建立，为探讨HSP在神经系统疾病发病中的作用奠定了基础，并提供了新的候选治疗靶点。

　　【关键词】 PC12细胞,双向电泳,蛋白质组学,热休克蛋白

　　热休克蛋白(HSP)是细胞内最重要的分子伴侣分子，除参与细胞内蛋白质的稳定性外，还对应激状态下的细胞提供保护。在多种方式诱导的帕金森病(PD)模型及病理标本上，均已检测到了HSP表达的明显变化，但至今还没有一次鉴定出多个HSP的报道。本实验采用蛋白质组学的方法可鉴定出PC12细胞内的多个HSP相关蛋白，为今后以PC12细胞为模型的神经病理学研究奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　11 材料 PC12细胞来源于中国科学院上海细胞库。DMEM购自GiBCO公司。新生牛血清由杭州四季青生物制品厂生产。3〔(3胆酰胺丙基)乙二胺〕1丙磺酸(CHAPS) 、两性离子电解质(pH 3～10)、二硫苏糖醇(DTT) 、固相pH 梯度干胶条(13cm,线性 pH 3～10 ) 、碘乙酰胺( IAA)、α氰基4羟基肉桂酸(CCA)等均购自Amersham Bioscience公司。谷氨酰胺、hACTH(1939)和AngⅢ购自Sigma公司。其余试剂均为国产分析纯。Ettan IPGphor Ⅱ等电聚焦仪、Ettan DALT 电泳系统、图像扫描仪，ImageMaster 2D Elite软件、切胶机、消化仪、点靶仪和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDITOF MS)均为Amersham Bioscience公司产品。

　　12 方法

　　121 PC12细胞培养 PC12细胞培养于DMEM培养基中，其中含10%的新生牛血清、1%L谷氨酰胺、100 μg/ml的青霉素和链霉素。培养条件为37℃、5%CO2，选用对数生长期细胞进行实验。

　　122 蛋白样品的制备及定量 收集样品细胞，离心，冷PBS洗3次。加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris)，液氮反复冻融后，室温静置。25 000 g离心30 min后取上清，Bradford方法定量蛋白浓度。

　　123 双向电泳 每块胶上样量为200 μg，与重泡胀液(7 mmol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，1% 两性离电解质，02% DTT)混合，加入IPG胶槽中，放入IPG胶条。置于Ettan IPGphor Ⅱ上，在20℃进行重泡胀和等电聚焦：泡胀6 h，30 V 6 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。一向等电聚焦结束后，胶条分别在含1%DTT和4%碘乙酰胺的平衡液(50 mmol/L TrisHCl pH 68、6 mmol/L尿素、30%甘油、2%SDS 和痕量溴酚蓝)中平衡15 min。然后转移至125%的SDSPAGE胶上端，在Ettan Dalt电泳系统中40 mA电泳30 min，然后用8 w恒功率电泳，直至溴酚蓝到达胶的底端。

　　124 凝胶图像扫描与分析 将二向电泳胶在20%三氯乙酸中固定1 h，热考马斯亮蓝染色。然后用10%乙酸脱色，直至背景清晰。图像扫描仪收集胶图，并用ImageMaster 2D Elite软件将所得的图象进行找点、背景削减和匹配。

　　125 蛋白质鉴定 用切胶仪切取蛋白质点，50%甲醇50 mmol/L碳酸氢氨脱色，干燥后加入20 ng/μl胰酶，37℃下作用2 h。用50% 乙腈05%三氟乙酸溶解肽段,等体积饱和CCA与之混匀，进行点样。MALDITOF MS进行蛋白质肽质量指纹谱的分析及鉴定。

　　2 结果

　　PC12细胞二维电泳图见图1。ImageMaster 2D Elite软件对所获的4张图谱分析后，共得蛋白点(879±24)个，重复性良好。从电泳胶上切取配对良好、散在分布的蛋白点45个，进行质谱鉴定。所得到的可信鉴定结果中，HSP蛋白5个，具体胶上分布见图1，每个蛋白的具体结果见表1，包括蛋白的NCBI号码、名称、期望值(错误鉴定的几率)、理论等电点及分子量。另外，在胶上可见到两个蛋白点均鉴定为6号蛋白，即热休克蛋白27，这可能是由于翻译后修饰所导致的。本研究中所鉴定的5种HSP，分属于低分子量HSP家族(sHSP)( 热休克蛋白 27)、 HSP70家族(Hsc70、75kDa葡萄糖调节蛋白、GRP78)和HSP90家族(GRP94)。

　　表1 蛋白质组学方法所鉴定的PC12细胞内的热休克蛋白(略)

　　所鉴定蛋白的胶上分布， 胶的左侧标志着相对分子量，上方示等电点

　　图1 PC12细胞二维电泳图(略)

　　3 讨论

　　蛋白质组学(Proteomics)直接以细胞内生理功能的执行者蛋白质为切入点，在整体水平上研究其组成与调控的活动规律。它的主要技术是利用双向电泳(2dimensional electrophoresis,2DE)分离蛋白，利用质谱等技术对它们进行鉴定，通过对比从大量的蛋白质中筛选出在各种生理病理过程的关键蛋白质〔1〕，目前已成为生命科学中的研究热点。

　　HSP是细胞内重要的分子伴侣，除了在基本的蛋白质合成、折叠、装配、转运和降解等过程中发挥作用外，同时还具有细胞保护作用，即当生物体受到环境中的有害因素引起细胞损伤时，大量HSP合成，维持细胞蛋白自稳，提高细胞对应激原的耐受性，使细胞维持正常的生理功能。按分子量大小HSP主要可以分为四个家族：HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族及小HSP家族。作为应激蛋白，HSP与多种神经系统疾病密切相关,对神经元具有保护作用,并且可能参与了某些疾病的发病过程。在神经病理学当中，HSP的紊乱可能作为蛋白错误折叠这一脑内病变生化基础的指示〔2〕。

　　HSP70是细胞内的主要伴侣蛋白，本实验鉴定出了3个HSP70家族成员，HSC70 固定表达并存在于非应激的正常细胞的胞液和胞核,又称结构型HSP70;Grp78、Grp75分别固定存在于内质网和线粒体。HSP70具有抗凋亡、减轻过氧化损伤及提高细胞应激能力的功能。有报道称HSP70的基因多态性可能影响PD的易感性〔3〕，同时HSP70能够减少错误折叠的αsynuclein，进而减轻其对神经细胞的毒性〔4〕。在1甲基4苯基1，2，3，6 四氢吡啶(MPTP)诱导的PD模型上，Hsp70减少了黑质细胞的凋亡〔5〕，故HSP70分子伴侣功能增强可能对PD治疗有益。

　　HSP27是sHSP 亚家族中的一员,其重要的生物学功能是保护细胞免受各种应激因素的损伤。此外，HSP27也可参与细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导调节等，还具有调节蛋白折叠、稳定细胞骨架蛋白等生物学功能。在由6OHDA诱导的PD模型中，HSP27过表达能够延缓细胞色素C释放、降低caspase活性，抑制凋亡〔6〕。

　　HSP90 家族作为细胞内许多功能蛋白的结合蛋白发挥着复杂的作用，其底物多为涉及信号传递的蛋白质，这些底物分子中有相当数量的蛋白质介入了细胞的抗凋亡调节。GRP94属于HSP90家族，是内质网最丰富的蛋白质之一，作为分子伴侣参与其他蛋白质的折叠、转运、合成等过程，抑制错误折叠的蛋白质的分泌;与细胞内的其他肽类蛋白质结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程。毒物N甲基4苯基吡啶离子(MPP+)诱导HSP90增加，是细胞对抗氧化应激的一种防御机制 〔7〕。

　　PC12 细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，目前已被广泛用做神经系统疾病的细胞模型的诱导。对该细胞系的蛋白质组进行研究，为进一步研究神经系统疾病的蛋白质组学奠定了基础。本研究运用双向电泳、图像分析、飞行时间质谱和生物信息学方法一次鉴定了PC12细胞系的几个HSP，为今后探讨HSP在神经系统疾病发病中的作用奠定了基础，并提供了新的候选治疗靶点，调控HSP表达将可能成为治疗某些神经系统疾病的一条新途径。

　　【参考文献】

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　　5 Dong Z，Wolfer DP，Lipp HP,et alHsp70 gene transfer by adenoassociated virus inhibits MPTPinduced nigrostriatal degeneration in the mouse model of Parkinson disease〔J〕Mol Ther，2005; 11：808

　　6 Gorman AM，Szegezdi E，Declan J,et alHSP27 inhibits 6hydroxydopamineinduced cytochrome c release and apoptosis in PC12 cells〔J〕Biochem Biophys Res Commun，2005; 327：80110

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