地西泮在不同脑温下对癫行为和脑内氨基酸含量的影响

　　作者：王玉,张慧敏,李良勇　　作者单位：安徽省教育厅重点科研项目(基金号：2000j1132zd)，安徽省科技厅重点科研项目(基金号：2000-095) 230022 合肥 安徽医科大学第一附属医院神经内科

　　【摘要】目的 初步探讨地西泮抗癫作用温度效应及其基本机制。 方法 通过性发作行为记录的方法，观察地西泮在轻度高温、常温、亚低温状态下对大鼠性发作和脑组织内谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)和GABA含量的影响。 结果 与常温作用相比，在轻度高温状态下和亚低温状态下地西泮分别显著延长和缩短了性发作的持续时间，分别显著增强和减轻了性发作的强度;与常温作用相比，在轻度高温状态下和亚低温状态下地西泮分别显著增高和降低皮层及海马内Glu、Asp含量，并且，仅在亚低温状态下，地西泮显著增高皮层及海马内GABA的含量。 结论 地西泮在脑较高温度状态下不利于其抗癫作用的发挥，而在脑亚低温状态下显著提高其抗癫作用,其机制与脑温对脑内氨基酸含量的改变有关。

　　【关键词】 癫,亚低温,谷氨酸,天门冬氨酸;?酌-氨基丁酸

　　[Abstract] Objective To explore the effect of brain temperature on the anti-epilepsy effect of diazepam and its basic mechanism. Methods Seizure behavior was recorded and brain glutamate, aspartate and GABA were measured through HPLC technique in PTZ induced epileptic rats under under hyperthermia，normal temperature and hypothermia. Results As comparted with that under normal temperature, diazepam significantly prolonged and shorten the seizure duration under hyperthermia and hypothermia respectively; And as comparted with that under normal temperature, diazepam significantly increased and decreased the content of glutamate, and aspartate in cortex and hippocampus under hyperthermia and hypothermia respectively. But only under hypothermia, diazepam significantly increased the content of GABA in cortex and hippocampus. Conclusion hyperthermia reduces the anti-epilepsy effect of diazepam, while hypothermia enhances the anti-epilepsy effect of diazepam. The mechanism might be related to the alterations of brain amino acids under different temperature.

　　[Key Words] Epilepsy; Hyperthermia; Glutamate; Aspartate; GABA

　　地西泮是目前临床上用于治疗急性癫发作的最常用药物，为苯二氮卓受体完全激动剂，对多数癫发作起到迅速终止的作用，但对一部分癫发作仅有较弱的作用或完全不起作用。有研究表明地西泮在常温状态下对缺血神经元不能起到保护作用，但在亚低温状态下对缺血神经元起到明显的保护作用，提示地西泮的作用受脑温的影响[1]。由于癫发作过程中伴随着脑内神经细胞温度的上升，此温度的改变可能影响了地西泮的抗癫作用。本实验通过对不同脑温状态下地西泮对癫大鼠惊厥行为影响的观察以明确脑温对地西泮抗癫效应的影响，同时检测癫大鼠皮层和海马内Glu、Asp、GABA水平，以初步探讨地西泮抗癫作用温度效应的基本机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组及模型制备 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量170~240g，实验室常规条件下喂养，随机分为6组：1.常温对照组：常温下腹腔注射与致剂等容量的生理盐水;2.常温PTZ组：常温下腹腔注射PTZ (80 mg/kg，Sigma，以下均同此);3.常温PTZ-地西泮组：常温下腹腔注射PTZ后，观察动物出现须动或咀嚼时，随即腹腔注射地西泮(10 mg/kg，以下均同此);4.轻度高温PTZ-地西泮组：将脑温诱导致39~39.5 ℃并维持10 min后，腹腔注射PTZ后，观察动物出现须动或咀嚼时随即腹腔注射地西泮;5.亚低温PTZ-地西泮组：将脑温诱导致32~32.5℃并维持10 min后，腹腔注射PTZ后，观察动物出现须动或咀嚼时随即腹腔注射地西泮。为利于组间惊厥强度的比较，本实验采用较大剂量的PTZ致，其致死率高。为了满足统计学的要求，我们采用10个动物作为一组致，除亚低温PTZ-地西泮组以外，其它各条件下的PTZ致组均重复2~3次实验以获得足够的实验动物数。

　　1.2 行为观察 参考Diehl的评估标准[2]，将动物癫发作的行为表现分为6级。0级：无反应;1级：须动，咀嚼;2级：头面部抽搐;3级：前肢或后肢抽搐;4级：四肢节律性抽搐;5级：四肢强直性抽搐并伴甩尾或翻滚。

　　1.3 脑温改变的诱导和监控 脑温的改变采用如下方法：将动物置于一塑料盒内，塑料盒底部和四壁附贴1cm厚的海绵以防动物烫伤。将置有动物的塑料盒浸入温度调节水浴箱中，水平至盒颈。分别将水温调节至0~2 ℃和60~62 ℃以获得闹温的降低或升高。脑温的监测用颞肌温度间接反映。将测温探头包埋入动物左侧颞肌深部贴近骨外膜并与测温仪(半导体氧化物温度传感器)连接，连续监测，调节水温直至目标颞肌温度稳定。颞温维持在39～39.5 ℃者为轻度高温， 32～32.5 ℃者为亚低温。维持10 min后进行动物致实验。

　　1.4 高效液相色谱荧光法检测氨基酸含量 各组大鼠实验结束时，即首次惊厥发作后3 h迅速断头断头取脑，冰上分离大脑皮质和海马预冷的生理盐水1∶9(W/V)匀浆 5 min，3000～3500 r/min 4 ℃离心15 min，取上清50 μl进行HPLC荧光法检测Glu、Asp、GABA含量。

　　1.5 统计学处理 实验数据以x±s表示，采用SPSS统计软件(11.0版)进行单因素方差分析，4个指标的数据方差齐性检验结果表明方差齐，各组数据两两比较应用最小差异法(LSD)，以 P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同脑温对地西泮抗癫效应的影响 常温PTZ组癫大鼠的存活率为28%;常温PTZ-地西泮组大鼠的存活率较常温PTZ组有所升高，为50%;亚低温PTZ组大鼠的存活率较常温PTZ组有所升高，为36%;亚低温PTZ-地西泮组大鼠的存活率则升高到81.8%;而轻度高温PTZ-地西泮组大鼠的存活率则降到25%。以上的存活率仅为单纯的比率观察并无统计学的比较研究。

　　与常温PTZ组比较(见表1内▽标记)，常温PTZ-地西泮组的第一次惊厥发作持续时间显著缩短(P<0.01)，惊厥发作强度显著降低(P<0.05);轻度高温PTZ-地西泮组的第一次惊厥发作持续时间显著延长(P<0.05)，惊厥发作强度稍有增强但差异无统计学意义(P>0.05);亚低温PTZ组第一次惊厥发作强度显著降低(P<0.05)，第一次惊厥发作持续时间稍有缩短但差异无统计学意义(P>0.05)。

　　与常温PTZ-地西泮组比较(见表1内*标记)，轻度高温PTZ-地西泮组和亚低温PTZ-地西泮组分别显著延长和缩短第一次惊厥发作持续时间(P均<0.01)，分别显著显著增强和降低第一次惊厥发作强度(P均<0.01)。

　　2.2 不同脑温对地西泮作用后脑内氨基酸含量的影响 与常温对照组相比(见表2，3内☆标记)，常温PTZ组及常温PTZ-地西泮组皮层和海马Glu、Asp含量显著增高(P均<0.01);与常温对照组相比，常温PTZ组皮层和海马GABA含量显著增高(P均<0.01)，但常温PTZ-地西泮组皮层和海马GABA含量差异无统计学意义(P>0.05)。

　　与常温PTZ组比较(见表2，3内▽标记)，亚低温PTZ组皮层和海马内Glu、皮层内Asp含量显著降低(P均<0.05);与常温PTZ组比较，常温PTZ-地西泮组、轻度高温PTZ-地西泮组和亚低温PTZ组皮层和海马内GABA含量差异无统计学意义(P>0.05)，亚低温PTZ-地西泮组皮层和海马内GABA含量显著增高(P均<0.05)。

　　与常温PTZ-地西泮组比较(见表2，3内*标记)，轻度高温PTZ-地西泮组和亚低温PTZ-地西泮组分别显著增高和降低皮层和海马内Glu、皮层内Asp含量(P<0.01，P<0.05)，但仅亚低温PTZ-地西泮组显著增高皮层及海马内GABA的含量 (P<0.05)。

　　3 讨论

　　脑内兴奋性神经递质与抑制性神经递质介导的两种神经冲动的动态平衡是维持大脑正常生理活动所必需的，前者包括谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)等，其中以Glu最为重要，后者主要系γ-氨基丁酸(GABA)。Glu能的过度激活则会导致癫发作并且和其后的癫点燃过程的启动密切相关，即与其后的自发性反复发作为特征的癫脑兴奋性易感性增高之可塑性改变密切相关[3]。相反，抑制性神经递质GABA通过作用于GABAA受体增加Cl离子内流促使神经细胞膜超极化而对抗神经细胞的兴奋性，从而抑制癫发作[4]。人类和动物癫急性发作过程中和发作后一定时间内均伴有脑内Glu含量的增加[5,6]，在本实验的PTZ致大鼠癫急性发作模型中，我们也观察到早期(癫发作后3 h)脑内Glu和GABA含量的增加，与文献[6]报道一致，但二者可能仍处于一种失衡状态[7]，GABA的增高系用来对抗癫发作过程中脑内Glu含量的增加的一种被动的自身保护性反应。研究表明在人类和动物的慢性癫的反复发作中，Glu的增加可能并非单次癫发作的始动因素，因为其增加发生在癫惊厥发作之后。这一发现似乎判定了癫脑内Glu含量改变研究意义的不重要性，但是，其重要性在于脑内Glu含量增加所引发的后继效应。Glu过度释放，作用于突触后膜Glu受体，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体敏感性增高，过度兴奋，这可能与癫单次发作的延长有关，同时其调控Ca2+通道开放，大量Ca2+内流引起突触后神经元迟发性损伤和胶质细胞增生等结构性改变以及突触功能性改变，这些改变导致大脑的癫放电域值降低，易于出现癫反复发作[8]。另一方面，GABA系在中间神经元内合成和分泌的，而在慢性癫中癫发作引发选择性的中间神经元的凋亡和坏死，导致GABA抑制性作用的不足[9,10]。因此，每一次癫发作可能都是癫脑兴奋性进一步增高这一恶性循环的又一次开始。近来，已有临床和基础研究表明首次癫样发作即予以正规抗癫治疗具有更好的预后，其机制被认为与及早减少或阻断癫脑兴奋性易感性增高之可塑性改变密切相关[11]。

　　地西泮是目前临床上用于治疗急性癫发作的最常用药物，我们的研究发现地西泮的抗癫作用明显受到脑内温度的影响，在轻度高温状态下，地西泮显著延长癫发作持续时间和增强癫发作强度，反之，在亚低温状态下，地西泮显著缩短癫发作持续时间和减轻癫发作强度。进一步的研究发现，地西泮能够轻度降低PTZ引起的海马内增高的Glu和天门冬氨酸(Asp)含量，但对皮层内Glu和Asp含量以及皮层和海马内GABA均无显著影响。提示，地西泮的抗癫作用主要是通过直接作用于GABA受体而不是通过改变脑内兴奋性或抑制性氨基酸含量来发挥作用的。本实验还发现，在脑轻度高温状态下，地西泮对癫大鼠皮层和海马内GABA无显著影响，但却显著增高了兴奋性递质Glu和Asp的含量，反之，在脑亚低温状态下，地西泮不仅降低了癫大鼠皮层和海马内兴奋性递质Glu和Asp的含量而且也显著增高了抑制性递质GABA的含量。虽然在脑亚低温状态下，地西泮对癫大鼠脑内Glu、Asp和GABA的改变可能后继于PTZ诱导的癫样发作启动之后，但Glu、Asp的降低和GABA的升高与癫发作持续时间的缩短和发作强度的减轻相一致，提示亚低温状态下，地西泮抗癫作用的增强与癫样发作大鼠脑内Glu、Asp和GABA的改变密切相关，并可能及早地减少或阻断癫脑兴奋性易感性增高之可塑性改变，从而对癫大鼠的后继癫反复发作行为的缓解有重要意义(此结果另作报道)。关于地西泮在不同脑温下对神经递质的影响机制目前尚不清楚，代谢的增高或降低虽可以说明兴奋性递质增高和降低，但却不能解释抑制性递质的改变。有研究报道，大量地西泮可降低脑温同时升高脑内GABA的含量，因此，究竟是低温升高了GABA抑或是地西泮升高了GABA，或者是二者的共同作用目前尚无定论，有待进一步的研究。

　　通过本实验，我们得出如下结论：地西泮在脑较高温度状态下不利于其发挥抗癫作用的发挥，而在脑亚低温状态下显著提高银杏达莫联合低分子肝素钠治疗短暂性脑缺血发作疗效观察其抗癫作用;地西泮在不同脑温状态下抗癫效应的不同与脑内兴奋性和抑制性递质的改变有关。

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