脂联素对大鼠原代Kupffer细胞白细胞介素10表达的影响

　　在大多数急性和慢性肝脏疾病进展过程中.各种促炎症因子和抑制炎症因子扮演重要作用Kupffar细胞是肝脏先天性免疫反应的重要组成成分，是肝脏中炎症因子的重要来源细胞，在各种外界刺激因素存在的情况下，可引起炎症因子的释故，包括肿瘤坏死因子(TNF)a、白细胞介素(IL)一6、活性氧簇(reartiveoxy}e,r}species,ti0哟除了促炎症因子，抑炎因子的降低也可能有助于肝脏炎症状态的形成，从而导致肝脏损伤例如,11，一10是种免疫调节因子，具有潜在的抗炎和免疫抑制功能,能够减少促炎因子的产生包括。和IL-1'4。脂联素是在脂肪组织中特异表达的脂肪因子，通过与其两种受体(AdipoR1和:AdipoR2)结合发挥抗炎、增敏胰岛素等生物学作用。近来有研究显示，脂联素和1L一10存在重要的联系一、那么在大鼠原代KUpI(':细胞中，月L:fl联素是否可以通过捉进II.一10的表达发挥其抗炎作用呢.　　1材料与方法　　1.1买验材料和主要试剂洁净级雄性}}-`istar大鼠，体重200一350to购白中国医学科学院动物所I)}}IEM培养墓干粉(Cibm，公司)}胎牛血清(}Tdycaorm公司)，TRIZOI试剂(Invitrobenlifeteclunuhgie、公司少}M一VT1.}.逆转录酶酶抑制剂.15Primer均购自Promeba公司11一i0EI.h试剂a购自中国佳美生物技术公司，脂联索购目pef}rulec'li公司。荧光定量I'CR引物由赛百盛公司合成1.2实验万法.　　1.2.1细胞分离与培养大鼠原代分离ILuPffer细胞应用两步胶原酶灌注，1ercull密度梯度离心以及选择性贴壁培养纯化获得。置于370C,5%i:0的培养箱中培养.　　1.2.2细胞观察鉴定印度墨汁检测江Ii6,l/乙几论h后，相差显微镜下观察原代I<rrl>I'fe:细胞，胞浆内呈现黑色颗粒，提示其吞噬功能_hupffer细胞的鉴定主要通过特异性抗体}T)1(CDbB)和ED2(CD163)的免疫荧光染色。　　1.2.3细胞上清中TL一IO含量测定o,a.5,I.o和1.5P别ml的脂联素处理Kupffe:细胞4,8,I2,1bh后收集_}几清200浏，采用酶联免疫吸附法1enzymelinkedimniunosorbentassay,ELT}A)，根据试剂盒说明进行操作.　　1.2.4实时荧光定量I'(a}法检侧TI一10基因的表达应用‘1"RIG()l试剂提取Kupffer细胞总Iil}A，采用40闪逆转录体系获得。D'\.1以二磷酸甘油醛脱氢酶t>=iBI'IT)为内参照，lI.一LO引物序列为产物12_5bp;CADPiT引物序列为，产物100。I'Cl}反应体系(20p.,T);Sybergreenmix(2x)10},,T，上游引物0.3p,T,卜游引物。.3浏，模板cDN.}I闪,ddld,07.4浏。在8联管或J6孔板加样后，3000r/min离心IOruin，匕机运行程序。在每个循环延伸后，收集荧光，并以荧光强度为纵坐标，循环数为横坐标，绘制曲线，以此计算每个样品的阂值子thresholdeve}e,Ct谊)，三孔重复，根据结果计算基因相对表达量、T.2.>统计学分析用STSS11.5统计软件进行数据的分析处理，结果以均数士标准差表示数据先进行正态性检验、方差齐性检验，符合_x几述条件者行重复测量方差分析和单因索方差分析及(l检验P;0.05为差异有统计学意义.　　2结果　　2.1 不同浓度脂联素对原代培养Kupffer细胞IL一1O分泌的影响0,0.5、t.0和1.5}g/ml月旨联索分别作少月于培养的原代Kupffe:细胞4、歇1之161r同一浓度的脂联素随着培养时间的延长，诱导Kupffer细胞IL一10分泌逐渐增加(P<0.05);而同一作用时间h，随着脂联素浓度的增加，I}upffer细胞IL一10分泌并没有逐渐增加(P}0.05)图1、。根据实验结果选取I6I，为下一步实验作用时间.　　2.2不同浓度脂联素作用16h后，对原代培养Kupffe:细胞Ir.-10基因表达的影响分h}}以浓度为氏0.5,1.。和I.5p,g}}r}l脂联素处理hupffer细胞16h。与对照组相比，1.0和1.5pg/ml脂联素处理组的IL-IO基因表达量显著增加(Pc0.05j,1.5}A,g/ml脂联素处理组的II一10表达量是对照组的1.5倍，而0.5pg/rid脂联素处理组的“一10表达量与对一照组相比未见明显增加各脂联素处理组间的11.--10基因表达没有明显差异(Y>0.05)(图2）。　　3讨论　　Kupffer细胞在肝损伤中具有重要作用，在各种致病因子作用下，肝脏细胞损伤导致I}upffe:细胞的激活，释放多种细胞因子，导致肝脏慢性炎症的发生持续的慢性炎症的存在，导致肝星状细胞的激活，H>t:转化为肌成纤维细胞，然后通过旁分泌和自分泌作用，使fast:增硫，合成大量的细胞外基质，ECM的分泌增加，降解减少，以致其在肝内大量沉积，肝纤维化逐渐形成s脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肤或蛋白质。近年来研究表明脂联素具有潜在的抗炎功能。在培养的脂肪细胞中，采用酒精处理后可以抑制脂联素基因和蛋白的表达}e在一些动物模型中，包括小鼠、大鼠和微型猪，长期酒精喂养显著地减少脂联素，nRN.1和蛋白的表达，而给与脂联素后则可以阻止酒精性肝损伤进一步发展。进一步研究表明脂联素不仅可以减轻巨噬细胞的早期炎症反应、抑制髓系单核细胞增殖、减少巨噬细胞活化能力，还可以抑制细胞的吞噬活性和脂多糖(LPS)诱导的细胞因子产生。　　脂联素通过什么途径来发挥抗炎作用呢?最近的研究发现TL一10可能发挥重要作用。Park等’2研究发现应用脂联素处理培养的巨噬样细胞系(R}W264.7)可以抑制LPS诱导的信号转导和TNF'cx表达，然而，加入II,一10中和性抗体后，其LPS诱导的'I'NF。表达恢复表明II.-10在脂联素发挥抗炎过程中具有重要作用;进一步研究发现脂联素可以促进R.AW264.7细胞分泌1L一10。已经有研究表明在大鼠Kuptfer细胞中脂联素通过影响IL一10诱导基因即HO一1发挥其抗炎作用.　　本组实验研究中，不同浓度的脂联素分别作用于原代培养的大鼠l}upffer细胞，Kupffer细胞IL一10的蛋白和基因表达量增加，提示脂联素可以通过刺激巨噬样细胞系iI一10分泌从而发挥其抗炎作用。脂联素在引起KuI>ffer细胞IL一10表达增加的同时，对炎性介质如TNFcx,II一6等的表达是否有影响，抗炎因子1I一10的增加是否影响其它炎性介质的表达等，尚需要进一部的研究.　　参考文献:　　Kiso K,Ueno S,Fukuda M. The role of Kupffer cells in carbon tetrachloride intoxication in mice[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin,2012,(06):980-983.　　Das SK,Balakrishnan V. Role of cytokines in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease[J].Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition,2011,(02):202-209.　　An L,Wang X,Cederbaum Al. Cytokines in alcoholic liver disease[J].Archives of Toxicology,2012,(09):1337-1348.　　O' Shea J J,Murray PJ. Cytokine signaling modules in inflammatory responses[J].Immunity,2008,(04):477-487.doi:10.1016/j.immuni.2008.03.002.　　Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis,an integrated cellular response to tissue injury[J].Journal of Biological Chemistry,2000,(04):2247-2250.　　You M,Considine RV,Leone TC. Role of adiponectin in the protective action of dietary saturated fat against alcoholic fatty liver in mice[J].Hepatology,2005,(03):568-577.　　Esfandiari F,You M,Villanueva JA. S-adenosylmethionine attenuates hepatic lipid synthesis in micropigs fed ethanol with a folate-deficient diet[J].Alcoholism:Clinical and Experimental Research,2007,(07):1231-1239.　　Song Z,Zhou Z,Deaciuc I. Inhibition of adiponectin production by homocysteine:a potential mechanism for alcoholic liver disease[J].Hepatology,2008,(03):867-879.　　Ajmo JM,Liang X,Rogers CO. Resveratrol alleviates alcoholic fatty liver in mice[J].American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology,2008,(04):G833-G842.　　Xu A,Wang Y,Keshaw H. The fat-derived hormone adiponectin alleviates alcoholic and nonalcoholic fatty liver diseases in mice[J].Journal of Clinical Investigation,2003,(01):91-100.